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目的:精神分裂症是一种以意识与行为不协调为主要临床特征,神经递质功能紊乱为典型病理改变的慢性、致残性精神类疾病,全球平均发病率约为1%,给患者及其照顾者带来了巨大的负担。作为第二代抗精神分裂症药物,奥氮平在临床上显示了优良的治疗效果,但部分患者在服用一段时间后出现药物作用抵抗现象。本组前期遗传学研究发现奥氮平作用敏感性与精神分裂症患者神经细胞谷氨酸代谢个体差异密切相关。服用奥氮平患者出现获得渐进性作用抵抗的原因是什么呢?奥氮平长期作用是否对神经细胞谷氨酸代谢与传递产生不利影响呢?带着这一关键科学问题本组展开了系统研究。方法:在第一部分研究中,为了探究奥氮平对神经行为的影响,整体水平对C57BL/6小鼠连续作用奥氮平（5 mg/kg）60天,同时设置MK801组作为阳性对照,采用旷场实验检测小鼠自发活动、前脉冲抑制检测感觉门控功能、高架迷宫实验检测小鼠焦虑情况。在第二部分中为探索奥氮平获得渐进性作用抵抗与药源性细胞应激性诱导突变是否有关,本组首先通过MTT实验确定奥氮平的离体给药剂量,分别采用Western Blot和免疫荧光染色法对奥氮平长期作用细胞中应激性诱导突变标记蛋白H2AX表达水平进行检测,再综合本组前期研究积累奥氮平作用抵抗人诱导型多功能干细胞（i PSCs）来源神经干细胞样本明确奥氮平抵抗与H2AX的关系。在第三部分中,为验证奥氮平长期作用是否对神经细胞谷氨酸代谢与传递产生影响,离体水平对SH-SY5Y和PC12细胞连续作用奥氮平（5,10,20μM）9周,采用比色法检测离体模型中谷氨酰胺合成酶（GLUL）活性变化情况;采用Western Blot检测离体和整体给药模型中谷氨酸代谢相关蛋白GLUL、PSD-95和NRG1的表达变化情况;采用免疫组化染色法检测GLUL和PSD-95在受试小鼠大脑皮层和海马区域中的表达变化情况。通过以上研究明确奥氮平长期作用对神经细胞谷氨酸代谢与传递的影响。在第四部分研究中,本组采用q RT-PCR和Western Blot探究线粒体融合分裂相关基因Drp-1和Mfn-2表达变化情况;采用Mito Tracker Green探针法探究线粒体数量变化情况;采用JC-1、Mito SOX Red探针法检测线粒体膜电位和ROS生成水平。基于前面奥氮平长期作用对神经细胞线粒体ROS生成以及融合分裂稳态作用的关键发现,本组选用线粒体分裂调控小分子药物AICAR和线粒体ROS清除剂乙酰半胱氨酸（NAC）作用奥氮平长期诱导SH-SY5Y和PC12细胞,通过Western Blot检测GLUL、PSD-95、NRG1和Drp-1蛋白表达水平的变化;比色法检测GLUL活性变化,通过以上研究明确奥氮平长期作用产生神经细胞谷氨酸代谢与传递功能变化与线粒体功能损伤的关联性,为后续逆转奥氮平治疗作用抵抗药物靶点开发奠定理论基础。结果:在第一部分研究中,行为学实验表明:相较于control组,奥氮平给药组小鼠自发活动能力并未改变（P＞0.05）,前脉冲抑制受损和焦虑情绪水平增加（P＜0.05）,提示奥氮平长期作用可影响正常小鼠神经行为。在第二部分研究中,首先确定了奥氮平的安全浓度（20μM）;Western Blot和免疫染色结果显示60μM以上奥氮平会导致SH-SY5Y细胞H2AX的表达升高,p-m TOR/m TOR的比值下降,UV照射阳性对照组H2AX的表达水平显著升高（P＜0.05）;低剂量的奥氮平（5,10,20μM）作用9周,细胞H2AX的表达并未发生改变;奥氮平作用抵抗i PSCs来源神经干细胞样本H2AX表达水平未显示显著性差异（P＞0.05）。以上结果表明奥氮平抵抗与应激性诱导突变无关。在第三部分研究中,奥氮平安全浓度范围（5,10,20μM）内,连续作用9周后,在谷氨酸代谢水平方面,相较于control组,20μM奥氮平作用组GLUL m RNA和蛋白表达水平以及GLUL活性显著下降（P＜0.05）;在谷氨酸传递水平方面,q RT-PCR结果显示相对于control组,20μM奥氮平作用组NRG1 m RNA的表达并未改变但PSD-95 m RNA的表达下降;Western Blot结果指出奥氮平会导致NRG1的表达增加,PSD-95的表达下降;然而脑组织中Drp-1,GLUL,NRG1和PSD-95蛋白表达并没有显著变化;脑组织切片免疫组化染色结果显示,较control组,奥氮平给药组大脑皮层GLUL和PSD-95表达降低,海马区PSD-95表达升高。以上结果从离体和在体两个层面均证明了GLUL与PSD-95是长期使用奥氮平致谷氨酸系统紊乱的重要靶点。在第四部分研究中,q RT-PCR结果显示Drp-1和Mfn-2的m RNA水平呈奥氮平剂量依赖性下降,其中Drp-1下降最显著（P＜0.01）;Drp-1蛋白的表达也呈同样的趋势下降（P＜0.01）;Mito Tracker Green荧光染色实验结果显示了奥氮平会导致线粒体数量减少;线粒体膜电位以及Caspase 9蛋白的表达未发生显著变化（P＞0.05）;线粒体ROS生成水平随着奥氮平长期作用逐渐增加（P＜0.05）。相较于奥氮平作用组,NAC可显著逆转长期奥氮平作用导致的PSD-95蛋白表达下降（P＜0.05）;AICAR可显著逆转奥氮平长期作用导致的Drp-1和GLUL表达下降（P＜0.05）且可挽救奥氮平长期作用导致的GLUL活性下降。以上结果表明线粒体功能损伤是介导奥氮平长期作用产生神经细胞谷氨酸代谢与传递紊乱的重要机制。结论:奥氮平长期作用可诱导神经细胞线粒体融合分裂稳态失调进而使得谷氨酰胺合成减少,同时导致氧化应激增加从而使神经细胞PSD-95失调,造成谷氨酸能神经递质功能紊乱,诱发精神分裂症样神经行为改变,并可能造成获得性奥氮平治疗作用抵抗。本研究使我们对精神分裂症患者产生奥氮平抵抗的分子机制有了进一步的认识,发现了线粒体融合分裂稳态失衡和ROS生成增加可能与产生上述现象有关,为后续改善奥氮平作用抵抗提供一个可行的思路。