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目的下丘脑是人体内的神经-内分泌高级调节中枢,在其发育的的关键时期,对内、外源性激素作用非常敏感。邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)是邻苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)的活性代谢产物,具有抗雄激素作用和拟雌激素作用,对下丘脑神经元的发育有可能产生干扰作用,但是相关研究少见报道。本研究通过体外试验探讨MEHP对新生大鼠的下丘脑神经元发育的干扰作用及其剂量反应关系模型;并通过MEHP对下丘脑神经元凋亡的影响,以及MEHP对雌激素/雄激素介导的神经元生长发育的影响,初步探讨其作用的途径及机制。方法(1)新生大鼠下丘脑神经元原代培养方法及神经元鉴定:在原代培养的下丘脑神经元中,采用改良的机械吹打法制单细胞悬液,培养液选用添加10%去类固醇血清的DMEM培养液,培养24h后将培养液更换为97%Neurobasal+2%B27+1%Glutamine培养液,以抑制胶质细胞的过度增殖。采用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学染色法鉴定下丘脑神经元;采用H-E染色、Nissl染色法染色以观察下丘脑神经元的形态学特点。(2)不同浓度MEHP(10-15mol/L-10-3mol/L)处理培养7d的下丘脑神经元,作用24h、48h分别MTT法测定吸光度值并且计算细胞活力以及抑制率,建立MEHP对神经元生长抑制作用的剂量-反应关系模型;测量不同浓度MEHP对下丘脑神经元神经突长度、胞体面积以及突起个数的影响,观察其对神经元发育的影响。(3)不同浓度MEHP处理神经元,Hoechst 33258免疫细胞染色法分析神经元凋亡情况并计算凋亡率;不同浓度E2/T处理神经元,MTT法测定吸光度值并且计算细胞活力,确定适宜的E2/T浓度用于后续试验;不同浓度MEHP与雌二醇(E2,10-7mol/L)或睾酮(T,10-7mol/L)联合处理培养的下丘脑神经元,测量不同浓度MEHP与E2或T联合处理组对下丘脑神经元神经突长度、胞体面积以及突起个数的影响,观察其对神经元发育的影响,并且,用Hoechst 33258免疫细胞染色法分析不同浓度MEHP与E2或T联合处理组对神经元凋亡情况的影响并计算凋亡率。结果(1)本研究原代培养的下丘脑神经元纯度可达到95%以上,并且神经元生长发育良好。(2)下丘脑神经元在不同浓度MEHP中处理24h后,10-15mol/L、10-13mol/L、10-11mol/L、10-9mol/L、10-7mol/L、10-5mol/L、10-3mol/L 折光性变差,胞体变小,神经突变短神经元突触之间的连接断裂。10-15mol/L、10-3mol/LMEHP组抑制率分别为30.1%和33.6%,均对神经元的生长具有明显的抑制作用,而10-9mol/LMEHP组抑制率为1.6%,对神经元的生长的抑制作用不明显,MEHP不同处理组对下丘脑神经元的抑制作用呈U型剂量-反应关系曲线。(3)MEHP处理过的细胞,染色质皱缩,呈现不规则形状,有凋亡小体出现。MEHP处理组与对照组比较凋亡率增加,且差异均具有统计学意义(P<0.05),10-3mol/L MEHP组凋亡率最高,为83.98%。(4)不同浓度E2/T处理组对神经元均具有促进生长作用,经过比较,本研究选取10-7mol/LE2/T作为后续试验的终浓度。(5)不同浓度MEHP与E2/T(10-7mol/L)联合处理培养的下丘脑神经元,对下丘脑神经元神经突的长度以及胞体面积均有不同程度的减少。与E2/T组比较发现,MEHP拮抗E2/T介导的下丘脑神经元的增殖作用。(6)10-7mol/L、10-5mol/L、10-3mol/LMEHP+E2/T(10-7mol/L)处理组凋亡率分别为 27.97%、42.8%、68.66%,与对照组比较,差别均具有统计学意义(P<0.05)。MEHP拮抗E2/T介导的下丘脑神经元的抗凋亡作用。结论本研究结果表明,MEHP可抑制下丘脑神经元的增殖,MEHP对下丘脑神经元的影响存在非单调性的剂量-反应关系。MEHP对下丘脑神经元具有直接致凋亡作用,MEHP拮抗性激素E2/T介导的下丘脑神经元的增殖作用及抗凋亡作用,但是其作用机制还有待进一步研究。