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流感是一种由流感病毒引起的人兽共患急性呼吸道传染病。近年来,流感在世界范围内频繁爆发,不仅给养殖业造成巨大经济损失,而且严重威胁人类的生命健康。免疫预防和药物治疗是目前防治流感的主要手段,但流感病毒亚型多,各亚型抗原易漂移,单纯依靠疫苗很难完全控制疫情;目前用于治疗流感的药物品种很少,临床毒株耐药性也日益严重,因此寻找新型高效抗流感病毒药物,对防治流感有十分重要的意义。我国中药资源丰富,蕴含了数百万种对人类各种疾病具有防治作用的天然活性化合物。而且中医中药防治流感和感冒具有悠久的历史和重要地位。然而,中药的药效成分不清楚、作用机制不明确、药效不稳定等问题严重困扰着中药的推广和发展。利用现代药理学、化学等方法探明中药的药效成分及其作用机制是中药实现现代化、走向国际化的必经之路。
黄芩具有良好的民间应用基础,广泛的药理作用,其主要药效成分为黄芩苷、黄芩素等黄酮类化合物。黄芩及以其为主要原料的中成药双黄连和清开灵在临床上被广泛用于防治感冒和流感。但有关黄芩黄酮、清开灵和双黄连抗流感病毒的实验评价及其作用机制研究很少。本实验旨在评价黄芩黄酮、清开灵和双黄连口服液体内外抗流感病毒活性,探讨其作用机制。利用H9N2和H1N12种亚型流感病毒鼠肺适应株人工感染BALB/c小鼠,研究黄芩苷、黄芩素、清开灵和双黄连对感染小鼠的防治效果;利用H1N1亚型流感病毒鼠肺适应株人工感染BALB/c小鼠,研究黄芩苷、清开灵和双黄连对小鼠肺内病毒复制的抑制,及其对小鼠免疫功能的影响。利用MDCK细胞感染模型,评定了黄芩苷、黄芩素和野黄芩苷对HgN2、H1N1和H5N13种不同亚型流感病毒的体外抑制活性,利用体外药物对子代病毒增殖的影响实验、不同时间点试验,研究黄芩苷抗流感病毒作用机制。通过黄芩苷对神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)的抑制活性,探讨黄芩苷对流感病毒的作用靶点。通过体内外抗炎活性实验探讨黄芩苷抗炎效应。
小鼠感染试验结果表明:黄芩苷、黄芩素、口服清开灵和双黄连对感染H9N2和H1N1亚型流感病毒小鼠有显著的生命保护作用。其中黄芩苷对感染H9N2和H1N1病毒小鼠的保护效果较好,生命保护率均为80.0％(p＜0.01);黄芩素对感染H9N2和H1N1病毒小鼠具有极显著的保护作用,生命保护率分别为60.0%(p＜0.05)和50.0%(p＜0.05);清开灵对感染H9N2和H1N1病毒小鼠具有极显著的保护作用,生命保护率均为70.0%(p＜0.01);双黄连对感染H9N2和H1N1病毒小鼠也具有极显著的保护作用,生命保护率分别为60.0%(p＜0.05)和50.0%(p＜0.05)。显著高于病毒对照组的(30.0%)。黄芩苷、黄芩素、口服清开灵和双黄连显著抑制了H9N2和H1N1亚型流感病毒引起的小鼠肺炎实变。与病毒对照组相比,黄芩苷组的肺指数明显降低(P＜0.01),肺指数抑制率分别为45.3%和38.3%,与利巴韦林的相接近(48.0%);黄芩素组的肺指数降低(P＜0.05),肺指数抑制率分别为16.2%和11.4%;清开灵组的肺指数明显降低(P＜0.01),肺指数抑制率分别为34.1%和35.3%;双黄连组的肺指数也明显降低(P＜0.01),肺指数抑制率分别为26.3%和24.6%。黄芩苷、清开灵和双黄连对小鼠肺内病毒增殖也表现显著抑制作用,药物组鼠肺病毒滴度显著低于病毒组的鼠肺病毒滴度(P＜0.01)。
免疫试验结果表明:黄芩苷、清开灵和双黄连对感染H1N1病毒小鼠脾脏和胸腺萎缩具有显著的阻止和改善作用,并能提升感染小鼠脾脏中CD4+/CD8+比率。感染病毒后第3d,清开灵显著提升小鼠CD4+/CD8+比率(P＜0.05);感染后第6d,黄芩苷、清开灵和双黄连均极显著提升小鼠脾指数、胸腺指数和CD4+/CD8+比率(P＜0.01)。黄芩苷、清开灵和双黄连还显著降低感染病毒小鼠肺组织中IL-6(P＜0.01)、IL-10(P＜0.01)、IFN-γ(P＜0.05)、TNF-α(P＜0.01)的含量,抑制H1N1病毒导致细胞因子的增加,对感染流感病毒小鼠起到良好的保护作用。
体外结果显示:MDCK细胞中黄芩苷、黄芩素和野黄芩苷对H9N2、H1N1和H5N13种亚型流感病毒均有抑制作用,其中黄芩苷效果较好,能完全抑制24h内子代病毒的增值,对病毒复制周期的前期有显著的抑制作用;黄芩苷能显著抑制流感病毒的NA活性,对H9N2、H1N1和H5N13种亚型流感病毒神经氨酸酶活性的IC50分别为0.47±0.09、0.50±0.08和0.49±0.06 mM。但是对HA的作用不明显。
体内外抗炎实验结果表明:黄芩苷对大鼠角叉菜胶导致的足跖肿胀有显著的抑制效果(P＜0.01);黄芩苷对醋酸诱导的小鼠血管通透性增强有显著抑制作用(P＜0.01);黄芩苷对脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞释放的NO的抑制率达76.9%。
综合各试验结果:黄芩黄酮、口服清开灵和双黄连均有明显的抗流感病毒作用。黄芩苷是清开灵和双黄连抗流感病毒的主要药效成分,神经氨酸酶很可能是其作用靶点。此外,黄芩苷的免疫调节及抗炎作用也是其发挥抗病毒作用的重要机制。