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研究背景及目的:大肠癌(colorectal cancer,CRC)是世界第四大常见肿瘤,致死率世界排名第二,在我国也是第四大常见肿瘤。由于发生发展过程涉及诸多因素,CRC的预防和治疗一直难以有突破性进展。估计未来10年CRC的全球负荷将增加60%。慢性炎症是现今公认的CRC的一种危险因素,它会诱发癌变并促进CRC的发生和发展。在诸多促癌的炎症因子中,IL-6起着核心作用。然而临床上抗IL-6的单抗对CRC却没有明显的效果,因此,探讨CRC中IL-6诱导大肠癌细胞增殖的相关调节因素,有利于筛选新的治疗靶点。精氨酸特异性单ADP核糖基化酶1(ART1)是炎症因子的正向调节因子,在肺泡II型上皮细胞中抑制ART1可以减少IL-6的释放。而我们之前的研究表明,ART1与CRC的多种生物学行为存在密切关系,更重要的是ART1敲低后可以减少IL-6信号通路的信号转导分子gp130启动子的磷酸化水平。然而,ART1对IL-6诱导的大肠癌肿瘤细胞生长影响及机制尚未见报道。因此,本课题拟探讨ART1是否能通过gp130对IL-6诱导大肠癌CT26细胞增殖产生影响及可能存在的机制,为CRC治疗找寻潜在的新靶点提供相关实验依据。方法:1.ART1和gp130在大肠癌组织中的表达采用免疫组化法检测54例大肠癌肿瘤组织及23例切缘对照组织中ART1和gp130的表达。对ART1和gp130的表达进行相关性分析。2.ART1敲低对IL-6诱导大肠癌CT26细胞增殖的影响选用三组CT26细胞:ART1敲低组(ART1-sh组),空载组(NC组)和未转染组(WT组),其中WT和NC组为对照组,ART1-sh组为实验组。(1)IL-6诱导大肠癌CT26细胞增殖1)CCK-8法检测不同浓度IL-6诱导大肠癌CT26细胞不同时间后细胞增殖活性。2)Western blot检测IL-6诱导大肠癌CT26细胞不同时间后c-myc、CyclinD1和Bcl-xl蛋白表达水平。(2)ART1敲低后IL-6诱导CT26大肠癌细胞增殖1)CCK-8法检测IL-6诱导三组大肠癌CT26细胞后细胞增殖活性。2)Western blot检测IL-6诱导三组大肠癌CT26细胞后c-myc、CyclinD1和Bcl-xl蛋白水平。3)平板克隆实验和Edu实验,检测ART1敲低对IL-6诱导三组大肠癌CT26细胞克隆形成和DNA合成的影响。(3)采用饮用DSS溶液法,建立肠炎小鼠模型。在肠炎小鼠侧腹部皮下接种NC组和ART1-sh组大肠癌CT26细胞,观察ART1敲低对IL-6诱导移植瘤生长的影响。3.ART1敲低对IL-6诱导大肠癌CT26细胞增殖影响的机制研究选用三组CT26细胞:ART1敲低组(ART1-sh组),空载组(NC组),未转染组(WT组),其中WT和NC组为对照组,ART1-sh组为实验组。(1)Western blot检测未经IL-6诱导或经IL-6诱导后,三组大肠癌CT26细胞中gp130和p-STAT3蛋白水平。(2)Q-PCR检测三组大肠癌CT26细胞中gp130和IL-6的mRNA水平。(3)免疫荧光双标法初步检测大肠癌CT26细胞中ART1和gp130的空间位置关系。(4)Western blot检测NC组和ART1-sh组移植瘤组织中gp130和p-STAT3的蛋白水平。结果:1.ART1和gp130在大肠癌组织中的表达人CRC肿瘤组织中ART1与gp130的表达阳性率均高于对照组织,二者的阳性率分别为90.7%和83.3%。二者在CRC肿瘤组织中的表达存在正相关性(P<0.05)。2.ART1敲低对IL-6诱导大肠癌CT26细胞增殖的影响(1)IL-6诱导大肠癌CT26细胞增殖1)不同浓度IL-6孵育大肠癌CT26细胞不同时间后,细胞的增殖活性在一定范围内随浓度和时间增加而增加(P<0.05)。2)IL-6诱导大肠癌CT26细胞不同时间后c-myc、CyclinD1和Bcl-xl蛋白水平在一定时间内随诱导时间的增加而增加(P<0.05)。(2)ART1敲低后对IL-6诱导大肠癌CT26细胞增殖的影响1)用不同浓度IL-6诱导三组大肠癌CT26细胞。ART1敲低组IL-6诱导细胞增殖的效应明显低于对照组(P<0.05)。2)IL-6诱导三组大肠癌CT26细胞。ART1敲低组IL-6诱导克隆形成率明显低于对照组(P<0.05)。3)IL-6诱导三组大肠癌CT26细胞。ART1敲低组IL-6诱导DNA合成能力明显减弱(P<0.05)。4)IL-6诱导三组大肠癌CT26细胞。ART1敲低组c-myc、CyclinD1和Bcl-xl的水平明显低于对照组(P<0.05)。(3)成功建立小鼠肠炎模型后,接种NC组和ART1-sh组大肠癌CT26细胞至小鼠侧腹部皮下,2周后移植瘤成瘤。ART1敲低组肠炎小鼠皮下移植瘤的体积明显小于对照组(P<0.05)。(4)肠炎小鼠ART1敲低组移植瘤中c-myc、CyclinD1和Bcl-xl的蛋白水平,均低于对照组(P<0.05)。3.ART1敲低对IL-6诱导大肠癌CT26细胞增殖影响的机制研究(1)未经IL-6诱导的三组大肠癌CT26细胞,ART1敲低组gp130蛋白水平低于对照组(P<0.05)。(2)未经IL-6诱导的三组大肠癌CT26细胞,ART1敲低组gp130mRNA和IL-6 mRNA的水平均低于对照组(P<0.05)。(3)IL-6诱导大肠癌CT26细胞,在一定时间范围内随着IL-6诱导时间延长,gp130和p-STAT3蛋白水平逐渐升高(P<0.05)。(4)IL-6诱导三组大肠癌CT26细胞,ART1敲低组gp130和p-STAT3蛋白水平均低于对照组(P<0.05)。(5)对大肠癌CT26细胞同时进行ART1和gp130免疫荧光标记,在ImageJ中对二者的共定位情况进行分析。结果提示,ART1和gp130在空间上具有中等强度的相关性。(6)肠炎小鼠ART1敲低组移植瘤中gp130和p-STAT3的蛋白水平均低于NC组(P<0.05)。结论:在人CRC肿瘤组织中ART1与gp130的表达阳性率均高于对照组,且二者存在正相关性。ART1促进IL-6诱导的大肠癌细胞增殖,其可能与通过使IL-6信号转导分子gp130表达增加,上调p-STA3,进而促进c-myc,CyclinD1和Bcl-xl表达有关。详尽机制有待深入研究。