前言肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)是以肺泡上皮细胞及内皮细胞损伤,成纤维细胞增殖,胶原过度沉积,肺泡结构遭破坏,最终导致肺功能丧失的一组慢性肺疾病。目前为止,抗炎及免疫调节药物治疗肺纤维化效果不好,因此寻找新的治疗方法迫在眉睫。半胱氨酸蛋白酶Cathepsins参与细胞外基质重建,在肺纤维化中发挥重要作用。与Catheps ins B, L, S比较而言,其中Cathepsins K是最为重要的胶原酶。研究表明,博来霉素能促进肺纤维化模型动物肺组织Cathepsins表达,Cathepsins缺陷的小鼠,肺纤维化程度更加严重,Cathepsins在肺纤维过程中降解过多合成的细胞外基质蛋白,减轻博来霉素诱导的动物肺纤维化。姜黄素(Curcumin)是从姜黄属(Curauma longa L.)药用植物姜黄的根茎中提取的一种多酚类色素成分,传统中医中,姜黄素应用由来已久。具有抗氧化,抗炎,促进伤口愈合。近年研究表明,姜黄素具有降血压、降血脂、防治动脉硬化,抗肿瘤,预防衰老、抗神经退行性老年痴呆如阿尔兹海默(Alzheimer’s dementia),防治类风湿性关节炎等作用；有报道称姜黄素抗肺、肝及胰腺纤维化作用。目的本实验通过一次性气管内注入博来霉素(bleomycin, BLM)建立小鼠肺纤维化动物模型,观察姜黄素对小鼠肺纤维化形成过程中不同时期的病理形态的影响与Cathepsins的相关性；检测姜黄素对巨噬细胞活化及TGF-β1的表达的影响,分析姜黄素影响Cathepsins表达的细胞学基础及分子机制；检测姜黄素对细胞凋亡的影响,分析姜黄素影响细胞凋亡与Cathepsins的相关性,从而探讨姜黄素抗小鼠肺纤维化作用机制。研究内容及结果1姜黄素对博来霉素诱导小鼠肺纤维化形态结构及细胞外基质的影响,探讨姜黄素抗小鼠肺纤维化的药效。C57BL/6雌性小鼠(18±3g),随机分为假手术组(简称对照组),模型组,姜黄素组,每组30只。模型组及姜黄素组小鼠气管内一次性注射盐酸博来霉素(0.1m1,0.025U/只),对照组小鼠气管内一次性注射等体积的生理盐水。造模后第2天开始灌胃给药,持续到处死动物的前一天。姜黄素组给予姜黄素200mg·kg-1·d-1,对照组及模型组生理盐水灌胃。各组动物于7,14,28d处死,取肺组织进行HE,Mallory染色,分别观察肺组织病理改变及胶原表达变化。结果表明,姜黄素能够减轻肺部的炎症改变,促进肺泡结构修复,改善细胞外基质的重建,降低胶原沉积,从而发挥抗肺纤维化的作用。2姜黄素抗小鼠肺纤维化作用机制研究2.1姜黄素对博来霉素诱导肺纤维化C57BL/6小鼠CathepsinsB,K,L,S表达的影响在姜黄素药效研究的基础上,应用Real time RT-PCR,免疫组化及Western blot等方法分别从mRNA及蛋白水平探讨姜黄素对博来霉素诱导肺纤维化不同时期Cathepsins B, K, L, S表达的影响。结果表明,姜黄素能够促进半胱氨酸蛋白酶CathepsinsB,K, L, S表达,与博来霉素组比较,分别在不同的时间点达到显著性增加。Cathepsins K (14d, P<0.01; 7d,28d, P<0.05); Cathepsins L (7d, P<0.05; 14d,28d, P<0.01); CathepsinsB(7d,P<0.01；14d,28d没有显著性差异)；Cathepsins S (7d,14d, P<0.01; 28d,P<0.05)。此结果说明,姜黄素在博来霉素诱导肺纤维化早期炎症阶段促进Catheps insB, S表达,在炎症后期纤维化阶段,促进CathepsinsK,L表达。从而促进细胞外基质的降解,减少基质过度沉积。2.2姜黄素对博来霉素诱导肺纤维化C57BL/6小鼠TGF-β1表达的影响免疫组化方法检测姜黄素对博来霉素诱导肺纤维化不同时期TGF-β1表达的影响。结果表明,模型组和对照比较显示,第7d、14d、28d两组之间的差异都达到显著性(P<0.01)；姜黄素组与模型组比较发现,7d姜黄素治疗组TGF-β1表达与模型组相比没有显著差异,但14d、28d博来霉素+姜黄素组TGF-β1表达比模型组显著降低(P<0.05)。结果说明,姜黄素在博来霉素诱导的肺部损伤炎症阶段后期降低TGF-β1表达,抑制TGF-β1下调Cathepsin K表达。从而促进细胞外基质的降解,避免基质过度沉积,改善肺纤维化,阻断TGF-β1的促纤维化作用。2.3姜黄素对博来霉素诱导肺纤维化C57BL/6小鼠肺泡巨噬细胞标记物CD68表达的影响免疫组化结果显示,模型组小鼠CD68表达随着时间延长逐渐低；模型组比对照组明显增加,第7d、14d、28d两组之间的差异都达到极显著(P<0.01)；博来霉素+姜黄素组与模型组比较发现,博来霉素+姜黄素组CD68表达都比模型组显著增加,其中第7、14d更加显著,P<0.01；第28d,P<0.05。结果提示姜黄素在炎症的早期促进巨噬细胞的活化,Cathepsin B, K,L,S表达增加可能与姜黄素促进巨噬细胞的活化有关。2.4姜黄素对博来霉素诱导肺纤维化C57BL/6小鼠肺组织细胞凋亡的影响TUNEL实验结果表明,正常组小鼠肺部观察不到凋亡细胞；博来霉素模型组凋亡细胞多集中在支气管周围炎症区,在大量炎性细胞浸润的区域,凋亡细胞相对较少。姜黄素治疗后,除了支气管周围有一些凋亡细胞外,大量凋亡细胞出现在炎性细胞密集的区域；第7d细胞凋亡最为严重,随着时间的延长,凋亡细胞逐渐减少；博来霉素模型组第28d,在细胞凋亡区域,肺组织出现空泡现象,肺泡结构塌陷；姜黄素治疗组随着时间延长,炎症逐渐消退,凋亡区逐渐趋于恢复。统计分析发现,姜黄素治疗组比博来霉素模型组显著增加,第7d、14d更为显著(P<0.01),第28d(P<0.05)。结果提示,姜黄素治疗后增加了炎症区细胞凋亡,通过促进炎症部位细胞凋亡,减少毒性产物释放,缩短炎症过程,加快修复过程,起到抗纤维化作用。免疫组化检测Caspase-3的表达,结果表明,Caspase-3在对照组小鼠肺组织不表达,而在博来霉素模型组及姜黄素治疗组都有表达。博来霉素模型组及姜黄素治疗组进行比较发现,组间没有差异。说明姜黄素引起的肺组织细胞凋亡增加,不是通过增加Caspase-3的表达来实现的,可能是通过其他途径促进细胞凋亡。根据姜黄素促进Cathepsins B,S在炎症的早期表达(P<0.01),姜黄素可能通过促进Cathepsins B,S的表达,促进炎症区细胞凋亡,减少炎性细胞因子及细胞毒性物质的产生,从炎症反应的起始阶段阻断肺泡炎的进一步发展,减轻肺纤维化发展。结论1姜黄素调节博来霉素引起肺纤维化大鼠细胞外基质的含量,降低肺组织炎症和纤维化的程度,而发挥预防和治疗肺纤维化的作用。2姜黄素防治肺纤维化小鼠的作用机制2.1姜黄素能够促进组织蛋白酶Cathepsins B,K,L,S表达,促进细胞外基质的降解,减轻博来霉素诱导的细胞外基质的沉积。2.2姜黄素能明显降低肺组织TGF-β1的活性,解除TGF-β1对CathepsinsB,K,L,S表达的抑制。2.3姜黄素能促进肺泡巨噬细胞的活化,直接清除炎性细胞和损伤死亡的细胞；并提高了CathepsinB,K,L,S表达,促进细胞外基质的降解。2.4姜黄素通过促进CathepsinB,S的表达,调节肺部细胞的凋亡,促进炎症区域细胞凋亡,促进肺泡结构修复。综上,姜黄素具有抗肺纤维化的作用。其作用机制可能通过降低TGF-β1的活性,促进肺泡巨噬细胞活化,升高肺组织Cathepsin B,K,L,S的活性,促进细胞外基质的降解；并通过调节肺部细胞的凋亡,促进炎症区域细胞凋亡,促进肺泡结构修复,实现姜黄素防治纤维化的作用。