【研究目的】外泌体是由多种细胞类型分泌的、直径为30-150 nm的微小膜泡,外泌体中富含各种核酸,蛋白质和酶类等。外泌体作为将特定蛋白质或核酸等物质远距离传递的媒介参与了肿瘤的发生发展,包括肿瘤细胞的迁移、侵袭、凋亡、肿瘤的血管形成及免疫抑制等方面。外泌体miRNAs是目前肿瘤研究的前沿热点,越来越多的报道显示,外泌体来源的miRNAs对肿瘤的发生发展有着重要的影响。在我们前期的实验研究中发现,miR-346在宫颈癌中通过靶定m RNAs的3’UTR区调控靶基因的表达,进而促进宫颈癌细胞的恶性行为,最终影响宫颈癌的发生和发展。基于外泌体的传递作用和miR-346的促肿瘤作用,本文旨在探讨含有高表达miR-346的外泌体对肿瘤细胞本身和肿瘤微环境相关细胞的影响、外泌体进入靶细胞发挥促癌作用的机制研究以及外泌体介导进入受体靶细胞的分子机制进行详细的阐述。【研究方法】首先利用差速超速离心法提取宫颈癌细胞上清液中的外泌体,通过透射电子显微技术、纳米粒子追踪技术和Western blot实验对提取的外泌体进行形态、大小、标志蛋白的鉴定。然后,构建了稳定表达miR-346的细胞系,提取外泌体,RT-q PCR检测外泌体中miR-346的表达,建立细胞共培养模型,并通过细胞划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验、细胞-基质粘附实验、细胞-细胞粘附实验、ELISA实验、小鼠异位成瘤实验和体内肿瘤转移实验等,探究高表达miR-346的外泌体在体内外的功能性作用。进一步通过生物信息学软件分析预测了miR-346在He La细胞和肿瘤相关基质细胞中可能的靶基因,并用EGFP荧光报告系统对其靶定作用进行验证,通过Western blot实验、RT-q PCR实验检测了miR-346对靶基因的调控作用。通过MTT实验、克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验、Western blot实验、RT-q PCR实验、ELISA实验探究了miR-346的靶基因的功能,最后通过挽救实验验证了miR-346是通过调控靶基因影响细胞功能的。接着,我们构建稳定表达绿色荧光蛋白和外泌体标志蛋白CD63融合蛋白的细胞系,提取外泌体,将其作用于He La细胞,荧光定位实验验证外泌体成功进入受体靶细胞;进而,提取高表达miR-346的外泌体蛋白进行银染结合质谱分析筛选与外泌体进入受体细胞相关的蛋白分子,通过大量文献查阅结合实验验证确定这一分子是CD44;然后对CD44进行Flag亲和纯化及质谱分析筛选CD44的相互作用蛋白,然后通过免疫共沉淀实验、免疫荧光试验、Western blot实验、q PCR实验、ELISA实验以及挽救实验最终确定外泌体进入受体细胞的详细分子机制。【研究结果】我们成功提取了含双层膜结构、直径为30-150 nm粒径、有CD63、CD9、TSG101等标志蛋白表达的外泌体。而且确定了外泌体可以进入受体靶细胞。通过构建过表达miR-346的稳定细胞系,提取外泌体并检测到miR-346的表达高于对照组。高表达miR-346的外泌体可以促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,同时能够促进肿瘤相关成纤维细胞的粘附作用和巨噬细胞的转化,在体内可以促进小鼠异位肿瘤的生长和肿瘤的肺转移。然后,生物信息学预测并通过实验验证在He La细胞中miR-346可以直接靶定并下调SMAD4的表达,在肿瘤相关基质细胞中miR-346直接靶定并上调SMYD3和Bcl-6的表达,通过分子生物学和细胞生物学实验确定了SMAD4对肿瘤细胞活性、生长、迁移侵袭能力的抑制作用,同时确定了SMYD3和Bcl-6参与肿瘤相关基质细胞为肿瘤转移提供条件的过程。另外,我们发现外泌体上的跨膜蛋白CD44可以通过与HYAL2相互作用并下调其表达,减弱HYAL2对透明质酸HA的降解作用,进而促进CD44与HA的受体-配体作用最终促进外泌体进入受体靶细胞。【研究结论】我们发现宫颈癌细胞来源的外泌体中富含miR-346,过表达miR-346的外泌体通过CD44与HA的受配体作用促进外泌体进入受体靶细胞。进入受体靶细胞后的外泌体释放miR-346,使靶细胞中的miR-346的表达升高,高表达的miR-346通过下调宫颈癌细胞中SMAD4以及上调肿瘤相关基质细胞中的SMYD3和Bcl-6的表达,促进宫颈癌的生长和转移。此外,体内动物实验也证明高表达miR-346的外泌体可以促进肿瘤的生长和转移。总之,外泌体作为携带各种信号分子的媒介,对肿瘤的发生、发展和转移起到的重要作用,同时可能为宫颈癌恶性肿瘤的诊断和治疗提供了新的分子基础。