研究目的:目前,对外伤性视神经病变（Traumatic optic neuropathy,TON）的治疗尚无明确有效的方法。临床上主要以激素和手术治疗为主,但二者的疗效不确切且尚无循证医学研究的支持。生物多肽因其高特异性有望成为TON治疗的新型药物。但是,肽类存在易降解,不稳定和半衰期短的问题,且很多普通肽细胞膜渗透和组织穿透能力很弱,难以穿过眼部屏障。这限制了它们作为治疗剂的用途,同时也对多肽递送系统提出了挑战。本研究旨在利用视神经钳夹（Optic nerve crush,ONC）模型模拟TON的急性视神经损伤过程,首先探讨不同致伤冲量与视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cell,RGC）及其轴突丢失的关系,以期深入理解疾病进程,科学选择疾病治疗的时机;其次,构建可高效负载神经肽的外泌体（exosome）新型生物纳米载药系统;最后,基于体内大鼠ONC模型,评估其在TON治疗上的可行性和应用潜力。方法:1.大鼠视神经钳夹模型的探究。1)利用自闭合反向夹持镊,在距视盘1.5mm处进行右侧视神经钳夹,钳夹时间分别为5s,10s,20s,建立不同损伤强度的SD大鼠视神经损伤模型,行Masson视网膜切片染色,评估模型成功建立。2)在不同钳夹时间下,于伤后1、3、5、7、14、21、28天行视网膜切片hematoxylin-eosin（HE）染色,评估视网膜组织的病理形态改变。3)在不同钳夹时间下,于伤后7、14、21、28、35天行SD大鼠OCT扫描观,评估视网膜的神经纤维层（Retinal nerve fiber layer,RNFL）的厚度变化。4)在不同钳夹时间下,于伤后7、14、21天行视网膜铺片检测βⅢ-tubulin+轴索数量,评估视网膜内神经纤维的丢失情况,行视网膜铺片检测RBPMS+RGC数量,评估视网膜神经节细胞的死亡情况。2.外泌体负载神经肽PACAP（Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP）系统的构建。1)从不同种类的视网膜细胞系中,利用超速离心法获得视网膜细胞外泌体。利用电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析仪及Western blot对其进行形态学、粒径范围及特征蛋白表达谱的鉴定。2)利用扫描激光共聚焦显微镜检测视网膜神经节细胞对DIR标记的exosome的摄取。3)利用流式细胞术检测不同视网膜细胞来源的外泌体与神经保护肽PACAP38的连接效率。4)利用扫描激光共聚焦显微镜检测视网膜神经节细胞对不同视网膜细胞来源exosome所负载的FITC标记的CP05-PACAP38的摄取并利用流式细胞术分析其摄取率。3.体内神经保护作用。1)利用视网膜铺片检测RBPMS+RGC数量,评估网膜神经节细胞的存活。2)利用OCT评估视网膜RNFL的厚度。3)利用Western blot及视神经切片免疫荧光染色检测神经再生蛋白GAP-43的蛋白表达,评估视神经的再生潜力。4)利用霍乱毒素B进行视神经示踪,评估距离钳夹部位不同距离的视神经再生数量。5)利用闪光视觉诱发电位（Flash visual-evoked potential,FVEP）进行N2P2波形的振幅及潜伏期检测,评估视神经功能。结果:（1）大鼠视神经钳夹模型的探究。1)视神经钳夹痕迹,指示造模成功。2)组织病理学检测显示从损伤第3天开始出现节细胞数目减少,于损伤第7天出现视网膜核层排列紊乱,此时尚未观察到RNFL及全层厚度变化,于损伤14天开始出现RNFL变薄,视网膜全层变薄,视网膜核层出现不同程度的紊乱。不同损伤程度的各组间无肉眼可见的显著差异。3)OCT结果显示损伤14天时RNFL明显变薄,一直延续到损伤21天,之后RNFL厚度减少趋势相对稳定,虽仍有下降但无统计学差异。不同损伤程度的各组间无肉眼可见的显著差异,神经轴索的βⅢ-tubulin+染色支持OCT结果。在损伤后的同一时期,RGC轴索的丢失程度与损伤冲量有关。4)RBPMS+RGC染色显示,视网膜神经节细胞于损伤第一周时大幅减少,于损伤第二周呈中度下降,相比于第一周下降比例有所缓和,之后RGC数目仍继续衰减,下降幅度趋于平稳。在损伤后的同一时期,RGC丢失程度随损伤冲量的增加而加重,差异有统计学差异。（2）外泌体负载神经肽PACAP38系统的构建。1)RGC源性外泌体(EXORGC)可以高效负载PACAP38进入RGC。2)流式结果显示FITC-CP05-PACAP38与EXORGC的连接效率为92.8%。3)流式结果显示FITC-PACAP38体外细胞摄取率为5.22%,EXORGC负载FITC-PACAP38系统(EXORGC-PACAP38)可使FITC-PACAP38体外细胞摄取率提高至95.7%。4)体内视网膜铺片结果显示相同时间内EXORGCRhodamine B-CP05-PACAP38系统可以提高Rhodamine B-PACAP38被视网膜组织摄取的效率。（3）体内神经保护作用。1)视神经损伤1周。i)损伤组RGC数量为706.31±15.8/mm2,EXORGC对照组为783.63±7.06/mm2,PACAP治疗组为791.37±10.63/mm2,EXORGC-PACAP38治疗组为865.22±18.42/mm2。PACAP38治疗组和EXORGCPACAP38疗组与损伤组相比均有统计学意义。EXORGC-PACAP38治疗组RGC存活率最高,与单纯的PACAP38治疗组相比有统计学意义。ii)OCT结果显示各组之间无统计学差异iii)F-VEP结果显示EXORGC-PACAP38治疗组和PACAP38治疗组相比于损伤组P2波潜伏期缩短,但两治疗组间无统计学差异。两治疗组较损伤组均不能改善P2波的振幅。2)视神经损伤2周。i)损伤组RGC数量为76.84±7.63/mm2,EXORGC对照组为90.48±3.6/mm2,PACAP治疗组为141.79±12.77/mm2,EXORGC-PACAP38治疗组为195.63±11.09/mm2。PACAP38治疗组和EXORGC-PACAP38治疗组与损伤组相比均有统计学意义。EXORGC-PACAP38治疗组RGC存活率最高,与单纯的PACAP38治疗组相比差异有统计学意义。ii)EXORGC-PACAP38治疗组相较与损伤组,可挽救RNFL的厚度的下降,差异有统计学差异。PACAP38不能挽救RNFL厚度的下降。iii)EXORGC-PACAP38治疗组较损伤组及PACAP38治疗组,Gap43的蛋白表达升高,差异有统计学意义。PACAP38不能增加视神经中Gap43的蛋白表达。iv)视神经的CTB示踪显示EXORGC-PACAP38治疗组的视神经再生能力最强,相比于损伤组或单纯的PACAP38治疗组,差异均有统计学意义。v)EXORGC-PACAP38治疗组较损伤组P2波振幅增高,潜伏期缩短,差异有统计学意义。PACAP38治疗组不能改善P2波的潜伏期。（4）毒性试验。治疗剂量的EXORGC-PACAP38未造成视网膜组织组织病理学改变,视网膜各层厚度改变,对应的眼底成像系统未见异常,未造成N2P2波振幅和潜伏期的异常。结论:1.在SD大鼠的视神经钳夹模型中,RGC的死亡和RNFL的变性丢失过程均分为两个阶段发生,即快速丢失阶段和缓慢丢失阶段。但是,二者并不同步,RGC的死亡先于视网膜内轴突的丧失,RGC丢失幅度大于RNFL变薄的幅度。在ONC后的同一时期,RGC丢失程度随损伤冲量的增加而加重,而RGC轴索的丢失程度与损伤冲量无关。2.PACAP38在大鼠ONC模型中发挥了一定的神经保护作用但是不能促进视神经再生。3.视网膜不同细胞来源的外泌体可以作为新型生物纳米载药系统,通过exosome锚定肽CP05与神经保护肽PACAP38形成连接复合体。加载了神经保护肽PACAP38的exosome仍可保持自身结构的稳定性。其中,视网膜神经节细胞源性外泌体相比于所测试的其他眼源性RPE细胞外泌体和Müller细胞外泌体展现出更高的PACAP38负载效率。在体外,可以增加源细胞RGC对PACAP38的摄取,大大提升了PACAP38与源细胞RGC相互作用的能力。在体内,可以迅速穿越视网膜内界膜屏障,布散至视网膜内层组织。4.EXORGC-PACAP38在大鼠ONC模型中介导高效的神经保护和神经再生效应,起到延缓RGC的丢失及促进视神经轴索再生进而改善视神经功能的作用。