研究背景:高血压在心血管疾病的发生发展中起着至关重要的作用,它是造成疾病死亡的主要危险因素。我国将收缩压≥140 mmHg和（或）舒张压≥90 mmHg定义为高血压。目前我国高血压的知晓率和控制率相对较低,提高高血压的诊断和治疗刻不容缓。高血压的发病机制极为复杂,包括血管重构、内皮细胞功能受损、交感神经活动亢进、肾素-血管紧张素系统激活、肾钠潴留、胰岛素抵抗等。它们通过改变血容量、心输出量和外周阻力最终影响血压。其中,血管阻力取决于小动脉和微动脉平滑肌细胞的收缩和舒张。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）在生物力学和血管活性物质的刺激下,通过控制血管直径直接驱动血管壁的收缩。血管平滑肌收缩状态的异常足以引起血压紊乱。细胞内钙离子（Ca2+）的增加是VSMCs收缩活性增加的关键步骤。Ca2+增加的途径包括:VSMCs膜去极化激活电压门控Ca2+通道,导致Ca2+内流;血管收缩激动剂与G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCRs）结合,激活磷脂酶C,从而催化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇转化为二酰基甘油和1,4,5-三磷酸肌醇（inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3）。后者与肌浆网上的IP3受体结合,Ca2+通道打开。Ca2+从肌浆网释放,胞浆Ca2+浓度增加。胞浆内增加的Ca2+与钙调蛋白结合并激活肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase,MLCK）,从而导致平滑肌肌球蛋白的调节轻链磷酸化和随后的平滑肌收缩。MLCK的缺乏可导致平滑肌收缩功能受损和血压降低。GPCRs大量存在于心血管系统,在血管收缩等生理过程中发挥着至关重要的作用。G蛋白信号调节蛋白（regulators of G protein signaling,RGS）通过结合活化的Gα亚基,加速三磷酸鸟苷（guanosinetriphosphate,GTP）的水解,负向调控GPCRs信号通路。已知RGS蛋白参与神经系统、心血管系统的生理病理过程以及肿瘤的发生发展。心血管系统中许多负责血管收缩的GPCRs都与Gαq亚基耦合,Gαq是G蛋白家族Gq/11的成员。目前在哺乳动物中发现了至少30个RGS蛋白,其中有一半以上对Gαq表现出GTP酶活化蛋白（GTPase-activating protein,GAP）活性,因此有可能影响血管张力。RGS蛋白家族的3个成员:RGS2、RGS4和RGS5,是在心脏和血管中高度表达的蛋白,且编码这三种蛋白的基因均位于人和小鼠的1号染色体上与血压变异相关的区域。已知RGS2的缺失可增强血管紧张素受体诱导的G蛋白激活,从而导致血压增高。RGS4和RGS5是心肌肥厚和心肌纤维化的关键抑制蛋白。最近发现RGS5可以防止VSMCs的增殖和减弱新生内膜的形成。由于RGS蛋白是GPCRs信号通路的重要调控因子,RGS蛋白上游调节机制的研究至关重要,然而调控RGS表达的机制还有待进一步研究。已知基因表达调控发生在转录和转录后多个水平,我们主要研究mRNA的稳定性。人类抗原R（human antigen R,HuR）是胚胎致死视觉异常（embryonic lethal abnormal vision,ELAV）家族的成员,它普遍表达于真核生物的多种细胞并且参与机体许多生理和疾病病理过程。HuR通过高亲和性和选择性结合靶基因mRNA上富含腺嘌呤（A）和尿嘧啶（U）的元件（AU-rich elements,AREs）,增加mRNA的稳定性,从而增加其蛋白的表达。HuR可通过稳定多种编码生长因子和凋亡因子的mRNA,参与调节细胞周期、细胞存活和凋亡等生理过程。此外,HuR也参与许多疾病的病理过程,其中研究最为广泛的是HuR与肿瘤的关系。HuR在口腔肿瘤、胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌和皮肤癌中高度表达,与肿瘤发生发展及预后相关。HuR还涉及慢性炎症、心血管系统、神经系统和肌肉系统的病理生理过程。有文献报道HuR与心肌梗死、心肌纤维化相关,但HuR在心血管疾病中的作用机制尚不明确。为了研究HuR在VSMCs中的潜在作用,我们构建了平滑肌特异性敲除HuR小鼠。前期研究发现,平滑肌特异性敲除HuR可以导致小鼠出现高血压和心肌肥厚。于是我们检测了肠系膜动脉在血管活性药物刺激后的收缩反应,发现平滑肌HuR的缺失使肠系膜动脉的收缩增强。由于RGS蛋白在GPCRs介导的血管收缩中起了重要的作用,并且我们发现RGS基因的3’-非翻译区（untranslated regions,UTR）具有与HuR结合的AREs。因此,本研究提出如下假说:小鼠平滑肌特异性敲除HuR后,通过下调RGS蛋白,进而增加GPCRs介导的肠系膜动脉VSMCs收缩,导致外周阻力增加和血压升高。本研究将应用α-SMA-Cre/loxp系统构建平滑肌特异性HuR敲除小鼠,探究HuR在高血压和血管平滑肌收缩中的作用及机制,为临床上高血压的诊断和治疗提供新思路及新方法。研究目的:1.探讨平滑肌HuR在高血压中的作用2.探究平滑肌HuR在血管收缩中的作用及机制。研究方法:1.实验动物1.1.动物模型的构建:应用α-SMA-Cre/loxp系统构建平滑肌特异性HuR敲除（smooth muscle-specific HuR knockout,HuRSMKO）小鼠。1.2.自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats,SHRs）与 Wistar 大鼠:10周龄约270-300g的雄性SHRs和Wistar大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。2.实验细胞2.1.小鼠平滑肌细胞系:购于美国ATCC公司。2.2.小鼠主动脉平滑肌原代细胞:分离4～6周CTR和HuRSMKO小鼠的胸主动脉,用贴块法提取原代平滑肌细胞。3.临床标本收集血管标本来自患有冠心病且需要手术切除部分血管的高血压和非高血压患者的血管组织,人体组织的使用经过山东大学齐鲁医院科研伦理委员会的审核批准。4.鉴定平滑肌特异性HuR敲除小鼠的敲除效率和组织特异性利用组织基因组DNA提取试剂盒提取鼠尾DNA,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增 HuR 和Cre 序列,2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型。分离小鼠主动脉和肠系膜动脉进行蛋白免疫印迹实验（western blot）、免疫荧光、免疫组织化学染色用于检测HuR的表达水平。为了确定组织特异性,提取小鼠脑、心脏、肝脏、骨骼肌和脂肪组织进行western blot,检测HuR表达水平。5.探究平滑肌细胞敲除HuR对小鼠表型的影响监测小鼠体重、心率;采用小动物无创血压测量仪测量不同月龄以及不同性别的对照（control,CTR）和HuRSMKO小鼠的收缩压、舒张压和平均动脉压。6.研究平滑肌HuR的缺失对心肌肥厚的影响采用超声测定CTR和HuRSMKO小鼠的射血分数、短轴收缩率、室间隔厚度、左室容积、二尖瓣内舒张早期血流速度与舒张早期峰值速度之比以及左室质量;测量小鼠的心脏重量与胫骨长度的比值;测量小鼠的心脏重量与体重的比值;心脏石蜡切片进行苏木素&伊红（haematoxylin and eosin,H&E）染色比较小鼠心脏大小;小鼠血管组织石蜡切片进行H&E染色以及免疫组化染色检测α-SMA用于观察比较血管中膜厚度。7.探究高血压患者和SHRs主动脉中HuR表达正常血压和高血压患者主动脉石蜡切片进行免疫组织化学染色检测HuR的表达;测量大鼠血压;Western blot分析Wistar大鼠和SHRs主动脉中HuR蛋白的表达。8.明确过表达HuR对HuRSMKO小鼠和SHRs的血压影响在小鼠尾静脉注射表达绿色荧光蛋白（green florescence protein,GFP）的对照病毒或HuR腺病毒,连续监测血压一周。取过表达GFP或HuR的小鼠主动脉和肠系膜动脉进行免疫组化染色和Western blot检测HuR的表达水平;同样在Wistar大鼠和SHRs尾静脉注射GFP或HuR腺病毒,连续监测血压一周。取注射腺病毒一周后的大鼠主动脉和肠系膜动脉进行免疫组化染色和western blot检测HuR的表达水平。9.探究HuR对外周血管收缩的影响取CTR和HuRSMKO小鼠肠系膜动脉二级血管,用去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）、内皮素（endothelin-1,ET-1）、U46619 和血管紧张素 Ⅱ（angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）刺激,检测肠系膜动脉对血管收缩药物的反应。10.探讨HuR对RGS蛋白的调节作用RNA免疫共沉淀实验验证HuR能否与RGS mRNA直接结合;半衰期实验明确平滑肌细胞过表达HuR是否影响RGS mRNA的稳定性。分离CTR和HuRSMKO小鼠的主动脉提取RNA和蛋白,实时定量PCR（RT-PCR）和western blot检测RGS2、RGS4和RGS5的表达水平。免疫组化检测小鼠主动脉平滑肌HuR与RGS2、RGS4和RGS5蛋白的表达。11.研究HuR对GPCRs介导的细胞内Ca2+的增加的调控作用用苯肾上腺素（phenylephrine,PE）刺激CTR和HuRSMKO小鼠原代平滑肌细胞,用Ca2+指示剂Fluo-4 AM检测细胞内Ca2+变化。在CTR和HuRSMKO小鼠原代平滑肌细胞中分别过表达RGS2、RGS4或RGS5,同样用PE刺激检测Ca2+变化。12.探究外源性RGS2和RGS5对HuRSMKO小鼠血压的影响在CTR和HuRSMKO小鼠尾静脉注射表达RGS2或RGS5的腺病毒,连续监测血压一周。取过表达RGS2或RGS5的CTR和HuRSMKO小鼠主动脉和肠系膜动脉进行免疫组化染色和western blot检测RGS2或RGS5的表达水平。13.研究过表达HuR对RGS2、RGS4、RGS5蛋白表达的影响在CTR和HuRSMKO小鼠尾静脉注射表达GFP或HuR的腺病毒,分离小鼠的肠系膜动脉进行western blot检测RGS2、RGS4、RGS5蛋白水平。14.统计分析所有数据采用均数±标准误表示。数据分析采用GraphPad Prism 6.0和SPSS 23.0（IBM软件）。所有数据都通过了正态分布和方差齐性检验。两组间均数比较采用独立样本t检验。两组连续血压变化比较采用重复测量方差分析。定义P<0.05为数据差异有统计学意义。研究结果:1.平滑肌特异性HuR敲除小鼠的构建我们将HuRflox/flox小鼠与α-SMA-Cre转基因小鼠杂交,最终获得HuRflox/floxα-SMA-Cre+小鼠,将该小鼠简称为HuRSMKO小鼠。而同窝出生的HuRflox/flox/α-SMA-Cre-小鼠作为对照,简称为CTR小鼠。我们分离了 CTR和HuRSMKO小鼠的肠系膜动脉用于免疫荧光染色,检测HuR和α-SMA的表达。结果显示,HuRSMKO小鼠肠系膜动脉平滑肌层几乎没有HuR的表达。Western blot实验结果证明:HuRSMKO小鼠的主动脉和肠系膜动脉中HuR蛋白水平明显降低。CTR和HuRSMKO小鼠的脑、肝脏、心脏、骨骼肌和脂肪组织中HuR的蛋白水平没有明显差异。以上结果表明,HuRSMKO小鼠血管平滑肌中HuR的敲除效果显著,且具有明显的平滑肌特异性。2.HuRSMKO小鼠在3月龄后表现出血压升高和心肌肥厚CTR和HuRSMKO小鼠的体重和心率在2月龄和4月龄时均没有显著差异。2月龄的CTR和HuRSMKO小鼠的血压并没有表现出明显差异,然而从3月龄开始,HuRSMKO小鼠出现较为明显的血压升高。超声心动图显示3月龄的雄性HuRSMKO小鼠的左室质量和室间隔厚度增加。与CTR小鼠相比,3月龄的HuRSMKO小鼠的心脏重量与胫骨长度的比值以及心脏重量与体重的比值增大。H&E染色结果显示,3月龄的HuRSMKO小鼠与CTR小鼠相比心脏增大。而2月龄CTR和HuRSMKO小鼠的心脏形态和功能均没有显著差异。CTR和HuRSMKO小鼠主动脉的H&E染色和免疫组化检测α-SMA的结果证明:HuR的敲除没有影响血管中层厚度。以上结果表明血管平滑肌敲除HuR可导致血压升高和心肌肥厚。3.过表达HuR可以降低HuRSMKO小鼠和SHRs的高血压与正常血压者相比,高血压患者主动脉组织中HuR的表达水平降低。与血压正常的Wistar大鼠相比,具有稳定遗传性高血压的SHRs主动脉中HuR蛋白水平也明显降低。过表达HuR后,HuRSMKO小鼠和SHRs的血压下降。4.HuR的缺失使血管平滑肌的收缩反应增强NE、Ang Ⅱ、U46619（一种血栓素类似物）和ET-1刺激后,HuRSMKO的肠系膜动脉段与CTR相比收缩更为明显。我们进一步研究了小鼠肠系膜动脉对NE的剂量反应,在10、30和100μM的NE刺激时,HuR缺失的肠系膜动脉收缩反应明显大于CTR肠系膜动脉。然而,CTR和HuRSMKO的肠系膜动脉对124mM KCl刺激的收缩反应没有显著差异。以上结果证实HuR的缺失增强了小鼠肠系膜动脉对血管收缩剂的反应,而且HuR对血管收缩的调节可能是通过GPCRs通路而非细胞膜电位去极化。5.RGS2、RGS4和RGS5是HuR的靶基因RNA免疫共沉淀实验结果显示,HuR能与RGS2、RGS4和RGS5 mRNA结合。RNA稳定性实验结果证明,与对照GFP相比,过表达HuR增加了 RGS2、RGS4和RGS5 mRNA的半衰期。我们还提取了 CTR和HuRSMKO小鼠主动脉平滑肌RNA进行RT-PCR。结果显示:HuR缺失导致RGS2、RGS4和RGS5 mRNA水平显著降低。Western blot和免疫组化染色结果显示,与CTR小鼠主动脉相比,HuRSMKO小鼠主动脉中RGS2、RGS4和RGS5蛋白水平显著降低。综上所述,HuR可以与RGS2、RGS4和RGS5 mRNA结合并增加其稳定性,从而增加RGS2、RGS4和RGS5蛋白的表达。高血压患者主动脉平滑肌中RGS4、RGS5的蛋白表达降低,但RGS2蛋白表达反而增高。而SHRs主动脉平滑肌中RGS2和RGS4的蛋白水平降低,而RGS5的蛋白表达增高。这表明:高血压的发病机制非常复杂,RGS蛋白表达除了受HuR调控外,还受其他蛋白的调控。6.HuR是通过RGS抑制GPCRs介导的细胞内钙离子增加绿色荧光钙指示剂Fluo-4 AM孵育原代VSMCs30分钟后,加入1mM的PE刺激,通过绿色荧光变化观察细胞内Ca2+含量的变化。PE刺激后,不论对照还是HuR缺失的VSMCs均出现细胞内Ca2+的短暂增加。与对照相比,HuR缺失的VSMCs的荧光强度和增长幅度更大。而过表达RGS2、RGS4或RGS5明显降低了 HuRSMKO细胞中PE诱导的Ca2+增加。综上所述,HuR是通过RGS抑制GPCRs介导的细胞内Ca2+增加。7.RGS2和RGS5可以降低HuRSMKO小鼠的高血压过表达RGS2或RGS5使HuRSMKO小鼠的收缩压明显降低。免疫组化染色和western blot结果显示,在尾静脉注射相应腺病毒后HuRSMKO小鼠主动脉和肠系膜动脉平滑肌中RGS2或RGS5蛋白水平升高到野生型水平。我们发现HuRSMKO小鼠的肠系膜动脉中不仅HuR蛋白水平可以通过HuR腺病毒升高到野生型水平,RGS2、RGS4和RGS5的蛋白与没注射HuR腺病毒的HuRSMKO小鼠肠系膜动脉相比也恢复到生理水平。研究结论:1.平滑肌敲除HuR导致小鼠出现明显的高血压和心肌肥厚;2.平滑肌HuR的缺失使血管平滑肌收缩增加;3.机制上,HuR与RGS2、RGS4和RGS5 mRNA结合并增加其稳定性,从而增加RGS2、RGS4和RGS5蛋白表达,负向调控GPCRs介导的细胞内钙离子增加;4.外源性HuR和RGS2、RGS5可以降低HuRSMKO小鼠的高血压。研究背景:动脉粥样硬化是冠状动脉、外周动脉和脑血管疾病最常见的病理基础。目前研究认为动脉粥样硬化起始于高脂血症、高血压等心血管危险因素引起的内皮功能障碍和血管炎症。血液中的脂蛋白从受损的内皮细胞进入动脉壁,炎症因子刺激巨嗤细胞和血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）吞嗤氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）形成泡沫细胞并堆积于血管内膜。脂质代谢紊乱、炎症和内皮损伤在动脉粥样硬化中起着重要作用。VSMCs作为构成血管壁的主要细胞参与了动脉粥样硬化的进程。正常动脉中层的VSMCs是高度分化和静止的,但与骨骼肌和心肌细胞相比,它们保留了去分化潜能和可塑性,可以从收缩表型转变为合成表型。病理状态下,VSMCs发生表型转换,増殖迁移进入血管内膜参与泡沫细胞的形成。VSMCs还可以分泌大量细胞外基质,形成纤维帽,在动脉粥样硬化早期防止斑块破裂。VSMCs的死亡和衰老不仅参与动脉粥样硬化斑块的形成,而且还促进晚期斑块的不稳定性。越来越多研究开始关注VSMCs在动脉粥样硬化中的作用,但具体机制尚不明确。自噬是真核生物细胞生存和细胞器质量控制的关键步骤,它通过降解大分子、蛋白质和细胞器,并回收分解产物,进行物质与能量循环。自噬体的成核、扩张以及与溶酶体的融合、降解产物的转运需要多种自噬相关基因（autophagy-relatedgenes,ATGs）编码的蛋白参与。目前,在酵母基因中己鉴定出超过30种不同的ATGs,其中大多数基因在黏菌、植物、瞒虫、苍蝇和哺乳动物中高度保守。有许多研究证明自噬在心血管疾病中的重要作用,如自噬对心肌细胞轻度缺血具有保护性作用,自噬还参与心肌肥厚和心衰的发展过程。近年来,自噬与动脉粥样硬化的关系也备受关注。巨噬细胞中ATG5具有抗动脉粥样硬化作用,平滑肌特异性敲除ATG7可促进动脉粥样硬化,内皮细胞ATG5和ATG7的缺失也可导致动脉粥样硬化斑块的形成。然而自噬在动脉粥样硬化中的作用以及调节机制复杂,有待进一步研究。腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase,AMPK）是调节细胞代谢和能量稳态的关键蛋白。AMPK是由一个催化亚基和两个调节亚基组成的异源三聚体。AMPK的亚基都有多种亚型,不同的亚型组成影响AMPK的定位和功能。最近的研究表明,AMPK能够在酵母细胞和哺乳动物细胞中参与自噬的调节。AMPK可以直接磷酸化并激活ATG1同源物ULK1来诱导自噬。AMPK还可以通过抑制雷帕霉素靶蛋白（mammalian TargetofRapamycin,mTOR）活性,从而间接激活自唾。除此之外,AMPK还能磷酸化自噬通路核心蛋白如ATG9、Beclinl、VPS34和RACK1等来调控自噬。因此AMPK的调控在自噬和自噬相关疾病的研究中至关重要。目前关于AMPK各亚基表达的调控机制尚不清楚,需要进一步研究。基因表达的调控发生在转录和转录后等多个水平,人类抗原R（human antigen R,HuR）作为一种RNA结合蛋白,可与靶基因mRNA结合发挥转录后调控作用[25,26]。已知高血压是动脉粥样硬化的危险因素之一,我们的研究发现平滑肌HuR的缺失可引起血压增高,于是我们用平滑肌特异性的HuR敲除（HuRSMKG）小鼠构建动脉粥样硬化模型进一步探究平滑肌HuR在动脉粥样硬化中的作用及机制。前期研究中,我们发现HuRSMKG小鼠的动脉粥样硬化斑块面积与CTR小鼠相比明显增加,且HuR的缺失可导致自噬缺陷。由于AMPK参与了自噬的多个过程,并且我们发现AMPKal和AMPKa2 mRNA的3’-非翻译区（untranslated region,UTR）上有与HuR的结合位点。因此,本研究提出如下假说:小鼠平滑肌特异性敲除HuR后,通过下调AMPKal和AMPKot2蛋白,进而引起自噬缺陷,促进动脉粥样硬化。我们的研究为动脉粥样硬化的诊断和治疗提供了新思路。研究目的:1.探讨平滑肌HuR在动脉粥样硬化中的作用及机制。2.研究平滑肌HuR在自噬中的调控机制。研究方法:1.实验动物:1.1.平滑肌特异性敲除HuR小鼠动脉粥样硬化模型的构建:平滑肌特异性HuR敲除（HuRSMKQ）小鼠的构建如前述。8周龄雄性CTR和HuRSMKG小鼠尾静脉单次注射表达D377Y突变的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9的腺相关病毒（rAAV/D377Y-mPCSK9）,每只小鼠注射量1.5xl〇n vg,Paigen词料喂养12周后进行后续实验。1.2.载脂蛋白E（apolipoproteinE,ApoE）基因敲除小鼠:8周龄雄性ApoE—小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。ApoE^小鼠分为正常词料组（normal diet,ND）和高脂词料组（high fat diet,HFD）进行喂养。2.实验细胞:2.1.小鼠平滑肌细胞系:购于美国ATCC公司。2.2.小鼠主动脉平滑肌原代细胞:提取4?6周CTR与HuRSMK(M、鼠的胸主动脉平滑肌细胞。3.研究动脉粥样硬化斑块中HuR的表达:ApoE（?）小鼠分别给予ND和HFD喂养12周后,分离其主动脉并提取RNA和蛋白,RT-PCR和western blot检测HuR表达;将ND组和HFD组小鼠主动脉石蜡切片进行免疫组化染色确定动脉粥样斑块中HuR蛋白表达;ox-LDL刺激VSMCs后提取细胞蛋白进行western blot检测HuR表达。4.探究HuR对动脉粥样硬化的影响:注射rAAV/D377Y-mPCSK9后的CTR与HuRSMKG小鼠在Paigen饲料喂养12周后取血、分离主动脉和心脏。血液离心后取血清检测总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三醋（trig丨ycerides,TG）、低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cho丨esterol,HDL-C）;主动脉大体油红0染色以及主动脉根部冰冻切片油红O染色观察粥样硬化斑块面积;主动脉根部冰冻切片MOMA-2、a-SMA免疫组化检测巨噬细胞、平滑肌细胞含量;Masson染色检测胶原含量;主动脉根部冰冻切片TUNEL、a-SMA免疫荧光以及cleaved-caspase3免疫组化染色检测凋亡;主动脉提取蛋白检测MMP2和cleaved-caspase3的表达;计算斑块易损指数,公式如下:（脂质含量百分比+巨嗟细胞含量百分比）/（平滑肌细胞含量百分比+胶原含量百分比）。5.探究HuR对自睡的影响:电镜观察对照和过表达HuR的VSMCs中自噬体数量;VSMCs过表达或敲低HuR后,用GFP-mRFP-LC3II腺病毒感染VSMCs,通过绿色和红色荧光变化观察自噬体和自噬溶酶体数量。6.探究HuR对AMPKal和AMPKa2的调节作用:RNA免疫共沉淀实验明确HuR能否与AMPKal和AMPKa2 mRNA直接结合;半衰期实验观察VSMCs过表达或敲低HuR是否影响AMPKal和AMPKa2mRNA的稳定性。VSMCs过表达或抑制HuR后提取细胞蛋白进行western blot检测AMPKal和AMPKa2的表达;分离CTR和HuRSMKG小鼠的主动脉提取RNA和蛋白,RT-PCR和western blot检测AMPKal和AMPKa2的表达。免疫组化染色检测小鼠主动脉平滑肌AMPKal和AMPKct2的蛋白表达。7.探究HuR对自噬相关蛋白的调节作用:VSMCs过表达或抑制HuR后提取细胞蛋白进行western blot检测pAMPKa、P62和LC3II的表达;分离CTR和HuRSMKQ小鼠的主动脉提取组织蛋白进行western blot检测p-AMPKa、P62和LC3II的表达。VSMCs过表达或抑制HuR后,ox-LDL刺激VSMCs检测AMPKa和LC3II的表达。8.研究激活AMPK对自噬和动脉粥样硬化的影响:VSMCs敲低HuR后,用AMPK激动剂A769662刺激细胞,western blot检测p-AMPK和LC3II的表达;CTR和HuRSMKG小鼠尾静脉注射rAAWD377YmPCSK9后Paigen饲料喂养并每日腹腔注射30mg/kg的A769662,12周后观察斑块面积、血脂及凋亡细胞数量变化。9.统计分析:数据采用均数±标准误表示,数据分析使用GmphPad Prism 6.0软件。所有数据均经过正态分布和方差齐性检验。两组间比较采用独立样本/检验,多组间两两比较采用单因素方差分析。P<〇.〇5为差异有统计学意义。研究结果:1.动脉粥样硬化斑块中HuR表达减少我们将ApoE（?）小鼠分为两组,分别给予ND和HFD喂养12周。Western blot结果显示HFD组主动脉中HuR蛋白表达减少。免疫组化染色结果显示,与ND组相比,HFD组动脉粥样硬化斑块中HuR蛋白表达减少。RT-PCR结果显示HFD组主动脉HuR mRNA水平显著降低。我们用ox-LDL刺激VSMCs并且在不同的时间提取细胞蛋白,western blot结果显示:在24、48、72和96小时oxLDL刺激后,VSMCs中的HuR蛋白表达水平下降。我们利用HuRs小鼠进一步研究HuR在动脉粥样硬化中的作用及机制。Western blot和免疫荧光结果证实HuRSMK(M、鼠主动脉平滑肌中HuR蛋白表达降低。2.平滑肌HuR的缺失促进动脉粥样硬化CTR和HuRSMKG小鼠尾静脉单次注射rAAV/D377Y-mPCSK9并给予paigen词料喂养用来构建动脉粥样硬化模型。油红0染色结果说明:与CTR相比,HuRs小鼠的主动脉和主动脉根部粥样硬化斑块面积显著增加。免疫组化染色检测巨噬细胞标志物M0MA-2的表达,结果提示:HuR的缺失使主动脉根部巨噬细胞浸润增加。然而全血细胞流式结果显示CTR与HuRs小鼠总体单核细胞含量没有明显差异。Masson染色结果说明:平滑肌细胞HuR的敲除降低了小鼠主动脉根部的胶原含量。CTR与HuRSMKG小鼠主动脉根部的VSMCs含量无显著差异。HuRSMKQ小鼠的斑块易损指数增加且HuRSMKQ小鼠主动脉MMP2蛋白表达增加,这可能导致斑块的不稳定性增加。综上所述,平滑肌HuR的缺失促进动脉粥样硬化。3.HuR的敲除増加了平滑肌细胞死亡主动脉根部冰冻切片进行TUNEL和a-SMA的荧光染色结果显示:与CTR相比,HuRSMKG小鼠主动脉根部TUNEL阳性VSMCs数量増加。同时,免疫组化染色结果表明:HuRSMKQ小鼠主动脉根部凋亡相关蛋白cleaved-caspase3的表达增加。此外,我们提取原代平滑肌细胞蛋白进行western blot,结果显示HuR敲除的VSMCs中cleaved-caspase3表达水平升高。因此,我们认为HuR的缺失导致动脉粥样硬化中平滑肌细胞凋亡增加。我们还检测了CTR与HuRSMKG小鼠的血脂水平,HuRSMKCM、鼠血清TC、TG、LDL-C水平高于CTR小鼠。4.HuR的缺失导致了自應缺陷VSMCs感染对照LacZ或HuR腺病毒48小时后,使用透射电镜观察自噬体。结果显示:过表达HuR增加了自噬体的数量。根据荧光蛋白GFP和mRFP对PH值的敏感性不同,我们利用GFP-mRFP-LC3II腺病毒感染VSMCs,48h后通过荧光变化来观察VSMCs中自噬体和自噬溶酶体含量。结果显示:过表达HuR的VSMCs中GFP+/RFP+和GFP/RFP+的点状荧光数目增加。然而,HuR缺失的VSMCs中GFP+/RFP+和GFP/RFP+的点状荧光数目减少。综上所述,HuR过表达可增加自噬通量,相反HuR的缺失可导致自噬缺陷。5.AMPKal和AMPKa2是HuR的班基因RT-PCR结果显示,HuRSMKG小鼠主动脉中AMPKal和AMPKa2 mRNA水平降低。为了检测AMPKal和AMPKa2是否为HuR的靶基因,我们进行了RNA免疫共沉淀实验,结果证实HuR可直接与AMPKal和AMPKa2 mRNA结合。稳定性实验结果显示:当过表达HuR时,AMPKal和AMPKa2 mRNA的稳定性增加。相反,敲低HuR时,AMPKal和AMPKa2 mRNA的稳定性下降。HuR抑制剂CMLD-2或HuR siRNA降低VSMCs中HuR表达水平后,AMPKal和AMPKa2的蛋白表达也随之减少。相反,通过HuR腺病毒或HuR重组蛋白使VSMCs过表达HuR,AMPKal和AMPKa2的蛋白水平升高。Western blot和免疫组化染色结果显示,CTR与HuRSMKG小鼠主动脉中AMPKal和AMPKa2蛋白表达减少。因此,我们得出结论:AMPKal和AMPKa2是HuR的靶基因。6.HuR正向调控自噬CMLD-2或HuR siRNA抑制VSMCs中HuR表达后,p-AMPKa和LC3II的蛋白水平降低,而P62的蛋白表达增加。相反,过表达HuR后,VSMCs中的pAMPKa和LC3II的蛋白表达增加,但P62的蛋白水平降低。除此之外,与CTR小鼠相比,HuRSMKCM、鼠主动脉中的p-AMPKa和LC3II蛋白水平降低,P62的蛋白水平升高。在敲低或过表达HuR后,ox-LDL刺激VSMCs的western blot结果进一步证实了HuR对AMPKa和LC3II表达的影响。综上,我们认为HuR正向调节自噬。7.AMPK的激活可抑制CTR和HuRSMKO小鼠的动脉粥样硬化VSMCs转染CTR siRNA或HuR siRNA后,用200 fiM AMPK激活剂A769662处理细胞。在对照和HuR缺失的VSMCs中,A769662使p-AMPKa和LC3II蛋白表达增加。CTR和HuRSMK（）小鼠在单次静脉注射rAAV/D377YmPCSK9后,每天腹腔注射30mg/kg的A769662并给予paigen饲料喂养12周。油红0染色结果显示,A769662处理后,CTR和HuRSMKG小鼠主动脉和主动脉根部的粥样硬化斑块面积显著减少。同时,凋亡细胞数量也明显减少,并且血清TC和LDL-C水平略有降低。我们得出结论:AMPK的激活可抑制CTR和HuRSMKO小鼠的动脉粥样硬化。研究结论:1.动脉粥样硬化斑块中HuR表达降低;2.平滑肌敲除HuR促进小鼠动脉粥样硬化;3.平滑肌HuR的缺失引起自噬缺陷;4.AMPKal和AMPKa2是HuR的靶基因;5.AMPK的激活可抑制CTR和HuRSMKO小鼠的动脉粥样硬化。