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猪血是一种可以大量获得、营养价值高且又廉价的优质蛋白资源。随着我国集约化养殖业的发展,屠宰生猪产生的副产物猪血急剧增加而且集中。但是目前在国内还没有一套成熟的、切实可行的用于猪血综合开发的生产工艺,导致其综合利用率低,除用作制备食用血豆腐和血粉外,大量猪血遭到废弃,这样既浪费了宝贵的生物资源又造成严重的环境污染。
本研究以猪血为原料,建立一套简便、高效、综合的分离纯化路线,用于超氧化物歧化酶(SOD)、凝血酶(TON)和血红素(Heme)的联合制备,充分发掘猪血资源化的作用,变废为宝,物尽其用,这不仅有助于降低生产成本,提高产品的附加值,获取更高的经济效益,而且对于建设资源节约、环境友好的社会也具有重要的意义,同时为猪血资源的进一步开发和实际应用打下基础。
实验中采用有机溶剂变性、热变性、丙酮沉淀、超滤、萃取、离子交换等技术,以提取过程中各阶段功能蛋白质含量或得率的变化为主要参考指标,对从猪血中联合制备超氧化物歧化酶、凝血酶、血红素的方法进行了研究,最终确定了一套可用于超氧化物歧化酶、凝血酶、血红素连续提取的新方法。主要研究结果如下:
(1)在乙醇—氯仿法变性去除红细胞中血红蛋白的基础上加入保护剂乳糖和激活剂氯化铜,能够一次性彻底地去除溶血液中的血红蛋白,解决了超氧化物歧化酶制备过程中血红蛋白去除的问题。建立了新的SOD生产制备方法,SOD粗酶液经过丙酮沉淀、热变性、柱层析和超滤冻干等步骤,制备的SOD比活为18400U/mg·Pro,回收率在70%以上,纯化效果显著优于已报道的其他制备SOD的工艺。
(2)冻融法去除血浆中的纤维蛋白原后,采用柠檬酸钡吸附和离子交换层析法从血浆中分离出凝血酶原,然后使用氯化钙对其激活得到了凝血酶。确定凝血酶原的激活条件为:氯化钙终浓度达到0.09mol/L,激活时间为45min,温度为37℃。本方法制备条件温和,纯化周期短,制备的凝血酶比活达到1250U/mg·Pro,回收率在60%以上,可应用于猪凝血酶的规模化制备。
(3)采用酸性丙酮抽提、醋酸钠结晶的方法成功地从血红蛋白中制得血红素。血红素制备的条件确定为:酸性丙酮抽提液中浓盐酸和丙酮的体积比为1:100,其使用量为红细胞体积的4倍,醋酸钠用量为1%。使用本方法可以从每升红细胞生成的血红蛋白中制备约3g的血红素。
(4)猪血资源化的目的就是提高其综合利用率和产品附加值。正是从上述的目的出发,最终建立了一套切实可行的、满足产业化生产的技术体系,该套工艺流程紧凑、有效,生产成本低而经济收益高,适合放大进行工业化生产。