【摘 要】
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颗粒细胞是卵巢中非常重要的细胞。从原始卵泡的生长、增殖、分化、闭锁、排卵到黄体形成,颗粒细胞的形态和功能都会发生各种变化。雌激素和孕激素是颗粒细胞分泌的两种重要的类固醇激素,发挥调控母猪排卵周期和维持妊娠的功能。microRNA（miRNA）是一种短的（20-24nt）非编码RNA,与目标基因的mRNA序列的3’UTR结合,促进mRNA的降解,在转录后水平调控mRNA的表达,抑制mRNA的翻译。以
【基金项目】
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国家自然科学基金（31802047）； 转基因生物新品种培育重大专项（2016ZX08006003）； 财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系；
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颗粒细胞是卵巢中非常重要的细胞。从原始卵泡的生长、增殖、分化、闭锁、排卵到黄体形成,颗粒细胞的形态和功能都会发生各种变化。雌激素和孕激素是颗粒细胞分泌的两种重要的类固醇激素,发挥调控母猪排卵周期和维持妊娠的功能。microRNA（miRNA）是一种短的（20-24nt）非编码RNA,与目标基因的mRNA序列的3’UTR结合,促进mRNA的降解,在转录后水平调控mRNA的表达,抑制mRNA的翻译。以前的研究表明,miR-10a在小鼠壁层颗粒细胞中高表达,促使颗粒细胞凋亡,并且miR-10a-5p在HEK293细胞中抑制羊毛甾醇合酶（LSS）从而抑制胆固醇生成。本研究以猪卵巢颗粒细胞作为研究材料,旨在探究miR-10a-5p在猪颗粒细胞类固醇激素合成中的作用与机制。本试验通过对猪卵巢颗粒细胞转染miR-10a-5p模拟物（agomir）或拮抗剂（antagomir）,研究miR-10a-5p对猪卵巢颗粒细胞类固醇激素合成的作用;运用转录组测序、生物信息学分析和双荧光素酶报告试验,预测并且验证了miR-10a-5p在猪卵巢颗粒细胞类固醇激素合成的潜在靶基因。获得的主要研究结果如下:1.miR-10a-5p在转录水平上抑制颗粒细胞能量代谢与激素合成在猪卵巢颗粒细胞中过表达miR-10a-5p后,通过mRNA转录组测序,检测出差异mRNA共344个,其中135个上调,109个下调。其中差异下调的mRNA主要富集在长链脂肪酰辅酶A生物合成、不饱和脂肪酸生物合成、分泌细胞分化调节等生物过程;富集在雌激素信号通路、碳水化合物代谢、WNT信号通路等信号通路。2.miR-10a-5p抑制猪卵巢颗粒细胞的类固醇激素合成在猪卵巢颗粒细胞中过表达miR-10a-5p后,ELISA结果显示miR-10a-5p显著抑制雌二醇（E2）（P<0.05）、孕酮（P4）（P<0.01）的分泌;显著下调类固醇激素合成相关基因Star（P<0.05）、Cyp11a1、3βhsd（P<0.01）mRNA表达和CYP19A1、3βHSD（P<0.05）蛋白的表达。相反,干扰miR-10a-5p后,猪卵巢颗粒细胞的E2、P4分泌显著增加（P<0.05）;显著上调类固醇激素合成相关基因Star、3βhsd（P<0.05）mRNA表达和CYP19A1、3βHSD（P<0.05）蛋白的表达。3.miR-10a-5p抑制猪卵巢颗粒细胞的胆固醇生成过表达miR-10a-5p后,Bodipy（P<0.05）和油红O染色试验（P<0.05）表明过表达miR-10a-5p能明显减少脂滴生成。能够显著抑制颗粒细胞中总胆固醇酯的含量（P<0.05）。胆固醇从头合成限速酶Hmgcr和高密度脂蛋白受体蛋白Scarb1的mRNA和蛋白水平（P<0.05）显著下降;相反,干扰miR-10a-5p后显著增加脂滴数量,促进总胆固醇的积累,显著增加HMGCR和SCARB1的mRNA和蛋白水平（P<0.05）。4.miR-10a-5p通过靶向抑制Creb1抑制猪卵巢颗粒细胞类固醇激素合成通过生物信息学分析软件,在预测得到的74个靶基因中筛选出环磷腺苷效应元件结合蛋白1（Creb1）。在培养猪卵巢颗粒细胞过程中,过表达miR-10a-5p显著抑制了Creb1的mRNA（P<0.05）和蛋白水平（P<0.01）的表达。构建Creb1的野生型和突变型双荧光素酶报告载体与miR-10a-5p agomir共转染猪卵巢颗粒细胞,发现miR-10a-5p能显著抑制Creb1野生型报告载体的荧光活性（P<0.01）,而对突变型没有影响。综上所述,miR-10a-5p能够特异性靶定Creb1 3’UTR,抑制StAR,CYP19A1,3βHSD的表达,从而抑制猪卵巢颗粒细胞的类固醇激素合成。此外,miR-10a-5p可以通过抑制猪卵巢颗粒细胞胆固醇代谢途径抑制类固醇激素合成。
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