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第一部分神经母细胞瘤中肿瘤恶液质的研究目的:神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见的颅外实体肿瘤,占儿童肿瘤的10%和儿童肿瘤相关死亡的15%。肿瘤恶液质(cancercachexia,CC)是常见的伴随肿瘤发生的多因素综合征,主要表现为体重减轻、骨骼肌减少。大约50%的肿瘤患者的死亡与肿瘤恶液质相关,为探究神经母细胞瘤患者肿瘤恶液质的发生机制,我们尝试建立神经母细胞瘤恶液质模型:KP-N-NS神经母细胞瘤模型,并初步探索其发生机制。方法:1、体内实验:将12只裸鼠随机分为两组,KP-N-NS组6只裸鼠皮下注射KP-N-NS细胞,PBS组6只裸鼠皮下注射等体积PBS;之后监测裸鼠体重及摄食重量,6周后处死存活裸鼠,收集裸鼠骨骼肌、心脏标本,用H&E染色方法观察裸鼠骨骼肌、心肌的变化,用免疫荧光方法检测骨骼肌中肌球蛋白(Myosin)表达水平,用免疫组化方法检测裸鼠骨骼肌中增殖、自噬、泛素化相关蛋白表达水平。2、体外实验:收集培养过KP-N-NS细胞的培养基作为条件培养基(conditioned medium,CM),用 CM(CM 组)、Angiogenin(血管生成素)(Angiogenin 组)培养 C2C12 细胞,用正常培养的C2C12细胞作为对照组,观察细胞数量及生存状态。诱导C2C12细胞分化3d,用CM、Angiogenin培养C2C12细胞24h,用免疫荧实验观察C2C12细胞肌管直径变化。用CM培养C2C12细胞15min、30min、1h、24h,提取相应蛋白质,用WesternBlot方法检测增殖、自噬、泛素化相关蛋白表达水平。用蛋白芯片方法检测CM中细胞因子表达变化。结果:KP-N-NS移植瘤裸鼠存活率下降,体重减轻,摄食减少,骨骼肌、心脏受累,骨骼肌Myosin表达下降,Fbxo32表达升高,成功建立KP-N-NS神经母细胞瘤恶液质模型。用CM处理后C2C12细胞数量减少,肌管直径减小,Stat3磷酸化水平升高,Akt、mTOR磷酸化水平下降。CM中Angiogenin表达水平明显升高。Angiogenin处理后C2C12细胞数量减少,肌管直径减小。结论:成功构建了 KP-N-NS细胞诱导裸鼠的恶液质模型,肿瘤恶液质状态下,Angiogenin、Myosin、Fbxo32、Stat3、Akt、mTOR 的表达水平明显异常,体外共培养实验显示Angiogenin可以导致细胞出现恶液质样改变。第二部分PLK1抑制剂RO3280诱导神经母细胞瘤凋亡及自噬的研究目的:Pololike激酶1(PLK1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,在包括神经母细胞瘤在内的许多肿瘤中过表达。PLK1抑制剂RO3280已被证明可以抑制白血病细胞的细胞生长。然而,RO3280对神经母细胞瘤的可能作用尚未见相关报道,本研究的目的是探索RO3280对神经母细胞瘤细胞的作用。方法:用CCK-8和集落形成实验检测神经母细胞瘤细胞生长情况,用Annexin V/PI染色和流式细胞术测定细胞凋亡和细胞周期,用荧光共聚焦显微镜和透射电镜检测细胞自噬,对Western Blot检测多种细胞凋亡和自噬相关蛋白表达情况,用PCR对神经母细胞瘤细胞的基因表达谱进行分析。结果:RO3280以浓度依赖性的方式抑制神经母细胞瘤细胞的生长,RO3280处理后的神经母细胞瘤细胞细胞周期发生G2/M期阻滞,细胞凋亡比例增加,LC3-GFP荧光斑点和自噬体明显增多,分割PARP和Caspase-3增高,LC3-Ⅱ表达升高,细胞凋亡、自噬相关基因的表达水平也发生相应改变。结论:RO3280通过诱导细胞凋亡和自噬,抑制神经母细胞瘤细胞的生长。