研究背景和目的心力衰竭影响着全世界约4000万人,在世界范围内造成沉重的卫生负担。扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy,DCM）在一般人群中发病率高达每250个人中就有1人,是心力衰竭的主要危险因素和主要常见病因,约占所有心力衰竭病例的36%~1。DCM定义为同时存在左心室增大和收缩功能障碍,排除高血压、心脏瓣膜病等原因,虽然较容易诊断,但疾病的原因远未明确2,3。DCM通常有遗传发病机制,具有遗传异质性、外显率和表达变异等特点。目前来自多个实验室针对DCM的发病机制相关的超过100个基因进行了研究,研究表明编码细胞骨架、肌节、线粒体、桥粒体和核膜等相关基因突变都与DCM的发生有关~4。然而这些DCM相关基因还不足以解释所有的DCM的遗传学病因,针对扩张型心肌病的遗传学机制,全外显子组测序的临床应用正在增加,DCM中罕见基因变异的识别和验证、对疾病进展和治疗反应方面的进展,将最终有益于DCM的精准医疗,并有望改善患者及其家属的预后。发现并纠正DCM中发生的分子异常功能,实现精准治疗,是急需解决的问题~5。一例严重的DCM引起我们关注,患者发病早,病情重,预后差,移植后仍然死亡。该患者没有其他可能导致DCM发生的危险性因素,针对DCM可能存在的遗传机制,我们对其DNA进行了全外显子测序,我们发现患者没有携带已知的可以导致扩张型心肌病发生的基因变异,经过进一步分析我们发现在其22号染色体的CHKB基因中的一个新发突变可能导致了DCM的发生。CHKB基因编码了磷脂合成通路的第一个关键酶胆碱激酶B,磷脂合成通路是哺乳动物细胞中合成主要磷脂磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）的通路,对于生命本身至关重要~6。磷脂代谢异常参与了很多疾病的发生发展,最近有研究发现心脏病理过程中磷脂代谢发生了变化,其潜在的机制尚不清楚7-10。CHKB敲除的小鼠可自发的发生幼鼠骨畸形和后肢肌肉营养不良,研究发现CHKB活性下降导致肌肉组织PC水平的降低和肌肉营养不良11,12。CHKB在心脏中催化磷脂从头合成途径中的第一个反应来合成主要磷脂PC,占有心脏胆碱激酶活性的95%13,但其在心脏中的作用尚未见报道。本文旨在研究DCM患者携带的CHKB的新发变异在DCM中作用及机制,探究DCM潜在的新的治疗靶点。研究方法与结果1.CHKB基因的新发突变导致了CHKB剪接异常和表达量下降本研究发现一例严重的扩张DCM患者,针对DCM患者可能存在的遗传机制,我们对患者及其父母的DNA进行了全外显子测序,经过候选基因策略及家系分析我们发现该患者携带的CHKB基因中的一个新发突变可能是其DCM的致病原因。我们对患者及其家属的DNA进行Sanger测序进一步验证和确定该突变是位于9号内外显子接头处的剪接位点的变异。利用c DNA扩增和生物信息学预测我们发现该位点的突变导致了CHKB剪接异常,表达了两个异常转录本。患者在15岁时表现出严重的DCM,心脏组织形态学显示DCM的变化,进一步通过荧光染色我们发现患者心肌组织中CHKB表达量下降,线粒体分布异常。2.CHKB新发突变敲入心肌细胞系的形态特征和磷脂代谢变化与CHKB敲除后的心肌细胞系相似我们为了进一步检测此新发突变对CHKB功能的影响和CHKB功能的缺失对于心肌细胞功能的影响,我们运用CRISPR-Cas9技术构建了CHKB新发突变敲入和CHKB敲除的细胞系。首先通过Western blot我们发现CHKB新发突变导致了CHKB表达量严重下降,CHKB敲除细胞系无法表达正常的CHKB。鬼笔环肽染色显示,CHKB新发突变敲入和CHKB敲除的细胞系的细胞形态异常,细胞变圆细胞面积增大。非靶脂质组学分析显示CHKB缺乏干扰了心脏磷脂代谢的平衡,导致了心肌细胞主要的磷脂发生了明显的下降,CHKB缺失导致的磷脂组成成分的变化与心衰时磷脂组成成分的变化一致。3.心肌细胞特异性CHKB敲低小鼠表现出DCM为了模拟患者的CHKB敲低的状态,我们通过腺相关病毒联合c Tn T启动子传递系统特异性敲低小鼠心肌细胞CHKB的表达。随后应用超声心动图进行定期检测小鼠的心功能,我们发现心肌特异性CHKB敲低的小鼠在没有任何压力应激的干预下在20周的时候小鼠的EF%明显下降,心脏左心室内径显著增加,利用血流动力学检测和单个心肌细胞收缩力检测我们发现心肌特异性CHKB敲低的小鼠的心肌收缩力显著下降。通过组织学染色我们发现CHKB敲低导致心肌纤维粗大,肌丝断裂溶解,心肌组织纤维化,符合DCM形态学的变化。4.CHKB基因敲低小鼠表现出磷脂代谢异常和心肌细胞线粒体缺陷我们接下来对疾病的相关机制进行探讨,转录组测序和KEGG通路富集分析表明,变化基因主要富集在与参与能量生产的通路中。考虑到磷脂紊乱可以导致线粒体功能障碍,通过磷脂含量检测我们发现CHKB下降导致了心肌组织和线粒体中的主要的磷脂PC和PE显著下降,并且线粒体磷脂下降更为显著。心脏组织透射电镜显示磷脂的紊乱导致了线粒体形态发生了最为明显的变化,线粒体压力试验及Western Blot显示线粒体功能受损,能量供应障碍。5.补充CDP-choline治疗可以改善CHKB基因下调小鼠的心脏功能针对CHKB缺乏导致的心功能障碍我们进一步寻找可能的治疗方法。CDP-choline是磷脂合成代谢通路中重要的代谢产物,研究发现CDP-choline可以增加磷脂的水平。近年来也有研究发现CDP-choline在心脏疾病中具有保护作用。我们接下来给予CHKB敲低的小鼠CDP-choline灌胃,然后定期利用超声心动图检测心功能,我们发现CDP-choline可以改善CHKB敲低的小鼠的心功能。血流动力学和心肌细胞收缩力检测表明CDP-choline挽救了CHKB敲低的小鼠的心肌收缩力。通过组织形态学染色,我们观察到CDP-choline改善了CHKB敲低所导致的心肌纤维肿胀断裂和心肌纤维化。6.补充CDP-choline能促进磷脂稳态和线粒体能量平衡最后我们通过胆碱代谢和磷脂代谢组学发现CDP-choline增加了体内的磷酸胆碱水平,增加了主要的磷脂PC和PE的水平。通过透射电镜,线粒体压力试验和Western Blot,我们发现CDP-choline改善了线粒体缺陷,增加了线粒体基质密度和嵴,改善了线粒体呼吸功能,增加了能量的产生。结论针对扩张型心肌病患者的遗传机制,我们发现CHKB基因的新发突变导致了CHKB表达量和活性的下降。CHKB表达量的下降导致了心肌细胞和线粒体主要磷脂水平下降。心肌特异性CHKB敲低的小鼠能够自发地出现心脏的扩张,小鼠心肌细胞收缩力显著下降。脂质代谢组学和转录组分析发现CHKB敲低导致小鼠心脏组织磷脂代谢的紊乱以及线粒体能量代谢的相关通路发生了最显著的变化。CHKB敲低导致了心肌细胞线粒体形态和功能受损。磷脂合成通路中的重要代谢底物CDP-choline可以增加PC和PE的含量,改善磷脂代谢紊乱。CDP-choline改善了线粒体形态缺陷,增加了线粒体基质密度和嵴,改善了线粒体呼吸功能,增加了能量的产生。这为我们提供了新的治疗扩张型心肌病的策略,即补充代谢通路中下降的中间代谢产物来纠正基因功能缺陷导致的代谢的紊乱。