【摘 要】
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目的:本实验旨在探讨亚低温疗法对气道滴注脂多糖（lipopolysaccharid,LPS）诱导的急性肺损伤（acute lung injury,ALI）小鼠线粒体凋亡通路的影响,探究亚低温对ALI的保护作用及机制。方法:36只雄性昆明小鼠按照随机数字表法被分为3组:对照组（C组,n=12）、亚低温组（H组,n=12）、常温组（N组,n=12）。在光源引导下,用微量进样器行气管插管,模型组（H、N
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目的:本实验旨在探讨亚低温疗法对气道滴注脂多糖（lipopolysaccharid,LPS）诱导的急性肺损伤（acute lung injury,ALI）小鼠线粒体凋亡通路的影响,探究亚低温对ALI的保护作用及机制。方法:36只雄性昆明小鼠按照随机数字表法被分为3组:对照组（C组,n=12）、亚低温组（H组,n=12）、常温组（N组,n=12）。在光源引导下,用微量进样器行气管插管,模型组（H、N组）按3mg/kg的剂量气管内滴注脂多糖,对照组采用同样方法滴注等量生理盐水。给药1h后,模型组开始进行物理控温,亚低温组控制肛温在33～34℃,常温组控制在36～37℃;对照组不予以温度干预。经持续温度干预4h、8h后分批处死小鼠,开胸取出小鼠肺脏;预冷生理盐水清洗血迹后分离小鼠右肺保存于10%多聚甲醛中,室温保存,用于后期进行石蜡切片,苏木精-伊红染色（HE）后,光镜观察组织病理改变并进行半定量评分;迅速剪取小部分左肺（约50mg）,立即剪碎放入胶原酶溶液中消化,制备单细胞悬液,经Annexin V-FITC及碘化丙啶（Propidium idide,PI）染色后,用流式细胞仪检测肺组织细胞凋亡率;余肺冻存在-80℃冰箱中,用于肺组织总RNA及总蛋白的提取,通过实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）检测半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶3（Caspase-3）mRNA转录水平,蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测原癌基因蛋白质c-bcl-2（proto-oncogene proteins c-bcl-2,Bcl-2）、bcl-2相关X蛋白质（bcl-2-associated X protein,Bax）、Cleaved caspase-3蛋白表达。结果:1.肺组织病理改变:对照组光镜下观察无或仅见轻微的病理损伤,亚低温组及常温组可见明显病理损伤,通过半定量评分,造模组评分显著升高（ALI模型金标准）,且同时段亚低温组较常温组明显下降（4h:0.83±0.41比5.67±0.82比7.83±0.75;8h:1.17±0.41比8.33±1.03比11.83±0.98）。组内不同时段比较,对照组无明显变化,亚低温组与常温组8h评分明显高于4h。2.肺组织中Caspase-3 mRNA表达水平:与对照组相比,亚低温组及常温组Caspase-3 mRNA表达明显升高,且同时段亚低温组较常温组明显下降（4h:1.00±0.08比1.96±0.27比4.75±0.37;8h:1.07±0.14比2.40±0.32比4.88±0.29）。组内8h与4h比较,对照组及常温组无明显变化;亚低温组随时间延长,表达水平有所升高。3.肺组织中Bcl-2、Bax、Cleaved caspase3蛋白表达:Bcl-2:与对照组比较,亚低温组明显升高,常温组4h明显升高,干预8h后明显降低;此外,同时段亚低温组较常温组明显升高（4h:0.35±0.05比0.94±0.06比0.83±0.08;8h:0.36±0.03比0.73±0.09比0.26±0.05）。组内8h与4h比较,对照组无明显变化;亚低温组及常温组随时间延长,表达水平明显下降。Bax:与对照组相比,亚低温组及常温组明显升高,亚低温组4h较常温组4h明显降低,但亚低温组8h较常温组8h差异无统计学意义（4h:0.53±0.07比0.77±0.06比0.86±0.06;8h:0.74±0.04比0.92±0.05比0.96±0.07）。各组8h与4h比较,Bax表达水平均明显升高。Bcl-2/Bax比值:与对照组比较,亚低温组明显升高,常温组4h明显升高,干预8h后明显降低;此外,同时段亚低温组较常温组明显升高（4h:0.66±0.03比1.23±0.09比0.97±0.07;8h:0.49±0.04比0.79±0.11比0.27±0.06）。各组8h与4h比较,Bcl-2/Bax比值均明显降低。Cleaved caspase3:与对照组相比,亚低温组及常温组明显升高,且同时段亚低温组较常温组明显降低（4h:0.42±0.08比0.59±0.05比0.75±0.09;8h:0.58±0.04比0.89±0.09比1.08±0.06）。各组8h与4h比较,均明显升高。4.肺组织细胞凋亡率:与对照组相比,亚低温组及常温组明显升高,且同时段亚低温组较常温组明显降低（4h:22.12±1.46比33.07±2.25比39.90±3.50;8h:23.03±1.92比41.20±3.05比54.60±4.97）。组内8h与4h比较,对照组无明显变化;亚低温组及常温组随时间延长,凋亡率明显升高。结论:亚低温可通过下调LPS诱导的急性肺损伤小鼠肺组织线粒体凋亡通路中Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达,降低细胞凋亡率,减轻肺组织损伤的严重程度。
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