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第一部分滤泡细胞毒性T细胞与NOD鼠免疫损伤进程的研究目的:在1型糖尿病的致病过程中,自身反应性CD8+T细胞通过与MHC I类分子递呈的抗原肽相互作用而被激活,通过释放穿孔素和颗粒酶以接触依赖性方式直接杀伤胰岛β细胞,是致1型糖尿病的主要效应细胞。细胞毒性CD8+T细胞是胰岛炎病变的主要参与者,且是致胰岛炎的主要效应细胞。最近研究发现一种新的CD8+T细胞亚群,该细胞亚群高度表达趋化因子受体5型(CXCR5)且在肿瘤和慢性病毒感染的研究中被证实具有较强的细胞毒性和促炎作用,该细胞又被称为滤泡细胞毒性T细胞(TFC)。本部分研究旨在探索TFC与1型糖尿病之间的关系,通过检测NOD鼠不同组织中滤泡细胞毒性T细胞(TFC)分布差异,及TFC细胞比例随NOD鼠周龄增长的变化,并检测NOD鼠TFC细胞亚群表达多种抑制性/刺激性表面标记物水平和分泌释放IFN-γ、Gr B的比例初步探索TFC对NOD鼠免疫损伤的影响。方法:将NOD鼠分为高血糖组Hi(两次重复血糖值>16.7mmol/L)和4周龄、10周龄、15周龄、20周龄、25周龄共六组,每组6-10只,取NOD鼠脾脏、淋巴结、胸腺组织,检测三种组织中TFC细胞数量,并对TFC细胞PD-1、TIM3、CD107a、KLRG1四种表面标记物表达量进行统计分析。检测并分析NOD鼠脾脏TFC细胞经PMA刺激前后分泌释放IFN-γ和Gr B的量。统计方法包括t检验、单因素方差分析、多组间比较使用Kruskal-Wallis检验。结果:TFC细胞在NOD鼠不同组织间分布存在差异,胸腺组织几乎无TFC,而脾脏TFC较淋巴结比例略高,但未达统计学差异。脾脏和淋巴结中TFC细胞比例随NOD鼠周龄增长呈上升趋势。TFC细胞比例较CXCR5-细胞亚群占总CD8+T细胞的比例明显低(P<0.01),但其表达的多种细胞表面标记均明显高于CXCR5-细胞亚群,其中除KLRG1表达量在两细胞亚群间无明显差异,而PD-1、TIM3、CD107a表达量(P<0.01)均显著高于CXCR5-细胞亚群。检测NOD鼠脾脏TFC细胞亚群释放IFN-γ和Gr B的量,经PMA刺激后的比例均高于CXCR5-细胞亚群的释放比例(P<0.05)。结论:随着NOD鼠周龄增长和免疫损伤的进行性发展,TFC细胞比例也伴随上升。虽然TFC细胞较CXCR5-细胞亚群比例低很多,但其表达多种抑制性和刺激性分子比例均明显高于CXCR5-细胞亚群。说明虽然TFC细胞比例低但其发挥的免疫效应及能力可能更强。且TFC较CXCR5-细胞亚群释放更高水平的IFN-γ和Gr B,经PMA刺激后仍然有相似结果。综上提示TFC可能参与T1D的某些环节并对1型糖尿病的致病起到一定作用。TFC对1型糖尿病的作用仍需后续进一步探索研究。第二部分不同人群外周血滤泡细胞毒性T细胞检测与差异分析目的:多种研究结果证实自身反应性CD8+T细胞是T1D发病机制中起重要致病作用的细胞亚群。滤泡细胞毒性T细胞(TFC)作为一种新发现的CD8+T细胞亚群在肿瘤和慢性病毒感染中发挥重要作用,具有较强的细胞毒性及促炎作用。本部分研究旨在通过检测并分析1型糖尿病患者(T1D),2型糖尿病患者(T2D)及健康对照组外周血PBMC中滤泡细胞毒性T细胞(TFC)比例差异和TFC释放Gr B的比例,以及不同病程T1D患者外周血TFC释放Gr B的比例差异,从而进一步验证TFC在1型糖尿的发病过程中或起到一定推动作用。方法:共纳入43例1型糖尿病患者,37例2型糖尿病患者,和30例健康对照者,空腹采血收集入组人群外周静脉血,分离外周血PBMC,分别检测并分析三组研究对象PBMC中滤泡细胞毒性T细胞(TFC)比例和TFC释放颗粒酶B(Gr B)的比例差异。统计方法包括t检验、单因素方差分析、多组间比较使用Kruskal-Wallis检验。结果:T1D患者外周血中TFC细胞整体比例(4.6±4.4%)较高于健康对照组(2.33±1.4%),与健康对照组间有统计学差异(P<0.05),但与2型糖尿病(T2D)患病组(3.85±1.8%)未到达统计学差异,而T2D患者与健康对照组之间外周血TFC比例存在明显差异(P<0.001)。三组研究对象外周血滤泡细胞毒性T细胞分泌Gr B的水平无明显差异。检测三组人群外周血CXCR5-CD8+T细胞亚群的比例,T1D与T2D以及T2D患者与健康对照组间CXCR5-细胞亚群比例存在差异(T1D vs T2D,P<0.05,T2D vs Control,P<0.005)。T1D患者CXCR5-CD8+T细胞亚群释放Gr B的比例(26.54±15.8%)明显较健康对照组(37.46±16.91%)及T2D患者组(44.74±16.92%)低,且与T2D组存在统计学差异(P<0.0001)。分别检测并对比初发1型糖尿病患者(病程<1年)和长病程1型糖尿病患者(病程>1年)外周血PBMC中滤泡细胞毒性T细胞比例发现两组间无明显差异,但长病程T1D患者外周血TFC释放颗粒酶B(Gr B)的比例(21.61±8.67%)高于初发T1D患病组(15.77±8.55%),差别具有统计学意义(P<0.05)。结论:外周血PBMC中滤泡细胞毒性T细胞在T1D和T2D的患者的比例均高于正常对照组,说明TFC与T1D、T2D的发病可能都有一定关系,虽然三组间TFC释放颗粒酶B比例无明显差异,但我们发现T1D长病程患者外周血TFC释放Gr B比例高于初发1型糖尿病患者TFC释放Gr B的比例,与我们第一部分对NOD鼠研究的结果相似,即随免疫损伤进程的发展,TFC持续性存在并可能参与慢性免疫损伤的过程。此外,我们发现T1D患者外周血中CXCR5-CD8+T细胞亚群释放颗粒酶B的水平明显低于T2D组和健康对照组,针对这群CXCR5-细胞亚群的功能我们尚不清楚,后续会展开相关研究。总的来说,我们的研究尚待进一步完善,扩大样本量并后续进行相关功能验证。