全球疾病负担研究（Global Burden of Disease Study）表明,肝胆疾病已经成为全球疾病死亡的重要原因,且发病率仍在不断上升。肝胆系统恶性肿瘤（主要包括原发性肝癌和胆道癌）是肝胆疾病死亡的重要原因。胆管癌（Cholangiocarcinoma,CCA）作为胆管上皮的恶性肿瘤,由于其早期症状不明显,多数CCA患者在诊断时已丧失了最佳手术时机,导致CCA预后不佳,死亡率高,5年生存率仅为10%。此外,随着人们生活水平及营养状态不断改善,非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）患病率已高达25%,成为全球最常见的肝病之一。NAFLD的病理变化是从单纯性脂肪肝（Nonalcoholic simple fatty liver,NAFL）逐渐发展为非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis,NASH）,继而可进展至肝硬化甚至肝癌或肝衰竭。NASH是NAFLD进展过程中的关键阶段,是NAFLD恶化的拐点同时也是防治的重点。然而,目前临床上还没有获批针对NASH的治疗药物。因此,探寻早期诊断标志物,探索发病新机制,发现药物治疗新靶点,是肝胆系统疾病基础研究和新药研发的热点和难点。肝脏是人体重要的代谢器官,肝脏在机体糖、脂肪、蛋白质、激素等内源性物质的吸收、分解、合成及转运等代谢过程中均起着重要调控作用。CCA和NASH发生发展过程中均伴随肝功能的改变,肝脏代谢功能异常引发的内源性物质代谢紊乱是CCA和NASH发病及进展的重要特征,代谢相关蛋白是重要的药物治疗靶点。基于液相色谱-质谱联用（Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS）的代谢组学技术是疾病代谢研究的重要手段。而传统的非靶向代谢组学方法存在代谢物鉴定和数据处理流程复杂,检测线性范围窄、重复性差、定量准确性和灵敏度低等缺点。因此,本研究建立了广泛靶向代谢组学技术,利用Scheduled MRMTM采集模式同时监测包括脂肪酸、氨基酸、有机酸、碳水化合物和胆汁酸在内的数百种代谢物,具有高覆盖度、高灵敏度、线性范围宽、重现性好等优势,可以更好的反映疾病状态下内源性物质代谢紊乱特征。本研究进一步利用广泛靶向代谢组学技术解析了 CCA和NASH内源性代谢物代谢变化规律,探索小分子代谢物标志物用于疾病诊断的预测效能,针对代谢紊乱的通路研究药物干预的效果并探讨其可能机制。第一部分 基于广泛靶向代谢组学的胆管癌代谢紊乱特征研究及诊断标志物筛选目的:建立基于LC-MS技术的广泛靶向代谢组学方法,解析CCA内源性小分子代谢物代谢紊乱特征,筛选可用于CCA诊断的生物标志物。材料与方法:1.收集健康对照及良性胆道疾病（Benign biliary diseases,BBD）、CCA、肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）、胆囊癌（Gallbladder cancer,GC）患者的血液样本共329份。2.应用广泛靶向代谢组学方法（衍生化与非衍生化两种方法）测定BBD与CCA患者血浆代谢物水平。应用单变量分析与多变量分析相结合筛选差异性代谢物。应用Metaboanalyst（http://www.metabo analyst.ca/）对差异代谢物进行代谢通路富集分析。3.基于超高效液相色谱-串联质谱平台建立并验证人血浆胆汁酸绝对定量的测定方法,解析BBD和CCA患者中胆汁酸代谢变化规律,采用Pearson相关性分析探索胆汁酸水平与临床特征的相关性。4.将来自健康对照、BBD患者和CCA患者的血浆样品随机等分为探索集和验证集以筛选用于CCA诊断的生物标志物。应用二元Logistic回归分析建立诊断模型,通过受试者工作曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）来分析生物标志物的诊断预测能力。通过SPSS计算曲线下面积（Area Under Curve,AUC）来评估预测准确性。用根据受试者工作曲线算得的“约登指数”作为阈值得到最佳Cut-off值。结果:1.BBD与CCA患者的年龄及性别无明显差异。CCA患者的肝酶水平（天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶）及胆红素水平（总胆红素、直接胆红素、间接胆红素）明显升高（P＜0.05）。2.本研究中建立的非衍生化广泛靶向代谢组学方法可以实现一针进样同时检测400余种代谢物标准品,在人血浆中可检测到的代谢物有221种;衍生化广泛靶向代谢组学方法下人血浆中可检测到且标曲线性良好的代谢物有104种。两种方法优势互补,检测到的代谢物种类包括脂肪酸、氨基酸、有机酸、碳水化合物和胆汁酸等,具有覆盖度高、灵敏度高、线性范围宽、重现性好等优势。3.应用广泛靶向代谢组学方法测定BBD及CCA患者血浆代谢物水平,筛选出差异性代谢物73种,其中CCA患者血浆中含量升高的代谢物57种,含量降低的代谢物16种。CCA患者体内发生紊乱的代谢通路包括:D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢,不饱和脂肪酸的生物合成,精氨酸生物合成,组氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,初级胆汁酸合成等。CCA患者血浆中升高倍数前十的代谢物中有7种为胆汁酸。4.本研究进一步开发了血浆中胆汁酸绝对定量检测方法,能够同时定量人血浆中的15种主要胆汁酸。该方法专属性、准确度、精密度、提取回收率、稳定性等均符合FDA规定的生物分析方法学要求。5.与健康对照和BBD患者相比,CCA患者血浆中胆酸（CA）、鹅去氧胆酸（CDCA）、熊去氧胆酸（UDCA）和石胆酸（LCA）等大部分游离胆汁酸水平明显降低（P＜0.01）。而从健康对照到BBD再到CCA患者,血浆中初级结合型胆汁酸,即牛磺胆酸（TCA）、牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）、甘氨胆酸（GCA）和甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA）等初级结合型胆汁酸水平逐步升高（P＜0.01）。由于CCA患者初级胆汁酸水平明显升高,次级与初级胆汁酸的比例明显降低（P＜0.01）。6.相关性研究表明总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶和碱性磷酸酶等临床指标与结合型胆汁酸呈正相关,而与CDCA、CA、UDCA以及次级/初级胆汁酸比例呈负相关。7.在探索集中,筛选了CDCA和TCDCA两种胆汁酸联合对CCA进行诊断,其AUC为0.983,敏感度为95.2%,特异度为95.0%,最佳Cut-off值为0.18。在验证集中胆汁酸标志物对于CCA诊断的敏感性及特异性均优于肿瘤标志物CA199（AUC分别为0.970、0.881,敏感性分别为85.7%、79.3%,特异性分别为93.3%、81.0%）。胆汁酸生物标志物在Cut-off值取0.18时也可很好的区分CCA和健康对照,其在探索集和验证集的AUC分别为0.990和0.987。此外,本研究选取的胆汁酸标志物,还可很好的区分CCA与其他肝胆恶性肿瘤。结论:CCA患者发生明显的代谢紊乱,氨基酸、脂肪酸、胆汁酸等代谢通路失调。与BBD患者及健康对照相比,CCA患者血浆中游离型胆汁酸水平降低,结合型胆汁酸水平升高。基于胆汁酸代谢物筛选得到了一组由两种胆汁酸（CDCA和TCDCA）组成的生物学标志物用于CCA诊断,其灵敏度与特异性均优于CA199,并能很好的与其他肝胆恶性肿瘤区分。第二部分 基于广泛靶向代谢组学的非酒精性脂肪性肝炎代谢紊乱特征研究目的:利用广泛靶向代谢组学和蛋白质组学相结合的方法解析NASH小鼠模型及患者的代谢紊乱特征,发现潜在的药物治疗靶点。方法:1.NASH小鼠模型建立:应用西方饮食喂养联合低剂量四氯化碳（CCl4）腹腔注射诱导NASH小鼠模型。模型组为西方饮食饲料喂养,饮水为高糖水;对照组为正常对照饲料喂养,饮水为自来水。模型组每周腹腔注射CCl4一次（用橄榄油将CCl4稀释5倍,按每g体重1 μl给药）,对照组腹腔注射同体积溶媒（橄榄油）。造模12周后,收集小鼠的血浆及肝脏组织样本。HE、油红、天狼星红染色进行模型验证。2.将对照组及模型组小鼠肝脏组织进行蛋白质组学分析,应用基因本体（Gene Ontology,GO）对差异表达蛋白进行功能注释,KEGG pathway对差异表达蛋白进行通路分析。3.应用广泛靶向代谢组学方法（衍生化与非衍生化两种方法）测定对照组与模型组小鼠血浆代谢物水平,单变量分析与多变量分析相结合筛选差异性代谢物。应用Metaboanalyst（http://www.metabo analyst.ca/）对差异代谢物进行代谢通路富集分析。4.收集30例健康对照及21例经肝脏穿刺病理确诊的NASH患者的血液样本,根据NASH CRN评分系统对NASH患者肝脏病理进行评分。应用广泛靶向代谢组学方法（衍生化与非衍生化两种方法）进行血浆代谢组学研究。结果:1.成功建立了NASH小鼠模型,肝脏病理显示:肝脏细胞内可见大量脂质沉积,肝脏组织内可见炎症坏死灶,小叶中央区及汇管区均有纤维条索形成。NAFLD活动度评分及纤维化评分明显升高（P＜0.01）。2.模型组小鼠肝脏蛋白质组学共筛选出差异表达蛋白80个。差异表达蛋白主要发挥的生物学功能以内源性物质代谢为主,其中涉及不饱和脂肪酸代谢、脂肪酸衍生代谢、脂质的生物合成等。差异表达蛋白主要涉及的通路包括:类固醇激素生物合成、不饱和脂肪酸的生物合成、亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、视黄醇代谢等。3.应用广泛靶向代谢组学测定对照组及模型组小鼠血浆代谢物水平,共筛选出差异性代谢物95种,差异代谢物富集的通路主要有:不饱和脂肪酸的合成,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,丁酸代谢,烟酸盐和烟酰胺代谢,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,初级胆汁酸合成等。4.NASH患者的年龄及性别与健康对照无明显差异。NASH患者的肝酶（天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶）水平显著升高（P＜0.01）,而高密度脂蛋白和肌酐水平显著降低（P＜0.05）。5.应用广泛靶向代谢组学测定健康对照与NASH患者血浆代谢物水平,共筛选出差异性代谢物39种,通路富集分析显示NASH患者中发生紊乱的通路主要包括:精氨酸生物合成,组氨酸代谢,D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,丁酸代谢,不饱和脂肪酸的生物合成,初级胆汁酸合成等。结论:肝脏组织蛋白质组学及广泛靶向代谢组学结果均表明NASH发病过程中肝脏代谢功能失调,脂肪酸、氨基酸、胆汁酸等代谢通路紊乱。NASH患者和小鼠模型血浆中代谢物水平升高前十的均以胆汁酸为主,提示胆汁酸代谢紊乱可能是促进NASH发生及进展的重要因素。第三部分 考来烯胺对非酒精性脂肪性肝炎的改善作用及机制探讨目的:考察了胆汁酸螯合剂考来烯胺对NASH小鼠模型胆汁酸代谢紊乱及肝脏病理的干预效果,并通过分析肠道菌群及肝脏转录组学探讨其可能的作用机制。方法:1.应用胆汁酸绝对定量方法分析NASH患者胆汁酸代谢特征。2.NASH小鼠模型造模方案同第二部分,用含2%考来烯胺的西方饮食饲料进行干预,考察考来烯胺的作用。收集小鼠的血浆、肝脏组织及粪便样本。HE、油红、天狼星红染色考察考来烯胺对NASH病理进程的影响。利用胆汁酸绝对定量分析考察考来烯胺对胆汁酸代谢紊乱的逆转作用。3.小鼠肠道菌群16s rDNAV3-V4高变区测序分析考来烯胺对肠道菌群丰度及组成的影响。4.小鼠肝脏转录组测序筛选考来烯胺给药对肝脏基因表达的影响,应用GO进行功能注释,KEGG pathway进行通路分析。5.IHC和Western blot实验验证考来烯胺对肝脏组织线粒体氧化磷酸化蛋白水平的影响。结果1.NASH患者总胆汁酸水平明显升高,所有初级结合型胆汁酸均升高,次级结合型胆汁酸中甘氨去氧胆酸（GDCA）、UDCA、牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）、GCDCA水平也明显升高（P＜0.05）。因此,利用胆汁酸螯合剂减少胆汁酸在肠道的重吸收有望逆转NASH患者和小鼠体内胆汁酸蓄积。2.与模型组相比,考来烯胺组肝脏脂肪变性及纤维化明显减轻,NAS评分明显降低（P＜0.05）,但肝脏小叶炎症和肝细胞气球样变无明显变化。3.考来烯胺可显著降低模型组升高的胆汁酸水平（β-MCA、CDCA、TUDCA及T-β-MCA）（P＜0.05）,还可不同程度上降低模型组小鼠升高的总初级胆汁酸水平（P＜0.05）及总次级胆汁酸水平,并改善模型组小鼠胆汁酸比例失衡。此外,考来烯胺组FXR激动剂型胆汁酸比例明显上升。4.肠道菌群分析显示模型组与考来烯胺组小鼠肠道菌群具有显著差异。属水平上,与对照组相比,模型组小鼠肠道菌群中毛螺旋菌属（Parasutterella）及嗜胆菌属（Bilophila）相对丰度明显升高（P＜0.05）;与模型组相比,考来烯胺组Parasutterella相对丰度无明显改变,Bilophila相对丰度显著降低（P＜0.05）,双歧杆菌属（Bifidobacterium）相对丰度明显升高（P＜0.05）。5.肝脏转录组结果显示,考来烯胺组与模型组差异表达基因所富集主要分子功能及细胞组分均与线粒体密切相关;KEGG通路富集分析显示:与模型组相比,考来烯胺组可以上调线粒体氧化磷酸化通路相关基因。6.肝脏免疫组织化学染色及Western blot实验结果表明考来烯胺可显著逆转模型组小鼠肝脏中线粒体氧化磷酸化相关蛋白（ATP5A1、SDHA、CYTB、COX1）表达水平的下调（P＜0.05）。结论:NASH患者及小鼠模型血浆中均存在明显的胆汁酸代谢紊乱,部分胆汁酸水平异常升高为主。考来烯胺可显著逆转NASH小鼠模型的胆汁酸蓄积及比例失调,并显著改善了肝脏脂肪变性及纤维化,降低了NAS评分,减缓了NASH的疾病进展。考来烯胺可能通过影响肠道内Bilophila及Bifidobacterium丰度及肝脏线粒体氧化磷酸化功能发挥延缓NASH进展的作用。