论文部分内容阅读
目的：
糖尿病引起内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）功能障碍所导致的血管生成受损是糖尿病缺血性疾病的重要病因。改善EPCs血管生成能力是治疗糖尿病缺血性疾病的重要策略。活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）在糖尿病和糖尿病并发症的发生和发展中起着至关重要的作用。金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一种富含半胱氨酸的蛋白质。作为有效的抗氧化剂，MT可有效清除或淬灭各种ROS。现有的研究中已经证明了MT在糖尿病并发症治疗中的重大潜力，例如内皮特异性过表达MT具有显著的抗糖尿病肾病作用。然而，在糖尿病中，MT对EPCs功能调节、修复内皮方面的影响及机制尚不清楚。本课题旨在探讨内皮特异性过表达MT是否能改善db/db小鼠后肢缺血（Hind LimbIscheamia，HLI）血流恢复和血管新生，并利用高糖（HighGlucose,HG）、缺氧（Hypoxia）模拟糖尿病体内病理环境，探讨内皮特异性过表达MT保护EPCs功能的分子机制。
方法：
1.使用密度梯度离心法从野生型（Wild Type，WT）小鼠和内皮特异性高表达MT（JTMT）小鼠骨髓中分离出MNCs（BM-MNCs）和EPCs（BM-EPCs）进行培养。
2.利用db/db小鼠构建HLI模型并分别尾静脉注射WT和JTMT小鼠BM-MNCs，然后通过血流灌注成像仪（Pericam Perfusion Speckle Imager，PSI）和免疫荧光方法评价db/db小鼠缺血后肢血流恢复和血管新生情况，考察JTMT BM-MNCs的治疗效应。
3.利用蛋白质印迹法技术、免疫荧光染色检测JTMT BM-MNCs中是否直接参与血管新生，减少氧化应激损伤。
4.使用密度梯度离心法从WT和JTMT小鼠骨髓中分离出EPCs进行培养，并鉴定。
5.体外模拟糖尿病HG/hypoxia环境，通过基质胶成管实验、跨内皮迁移实验、细胞流式术，DHE（Dihydroethidium）染色考察MT在对EPCs成管、跨内皮迁移（Transendothelial Migration，TEM）、凋亡及ROS水平的影响。
6.利用蛋白质印迹法技术检测MT是否维持了糖尿病环境下EPCs中的促血管再生信号通路（Hypoxia Inducible Factor-1/Stromal Cell Derived Factor-1/Vascular Endothelial Growth Factor，HIF-1α/SDF-1/VEGF）。
7.利用HIF-1αsiRNA抑制HIF-1α表达，通过蛋白质印迹法、基质胶体外成管实验、跨内皮迁移实验和DHE染色实验，进一步验证MT是否通过维持HIF-1α/SDF-1/VEGF信号通路保护EPCs功能。
结果：
1.与移植WT-MNCs的小鼠相比，移植JTMT-MNCs的db/db小鼠HLI模型后肢血流恢复更快，新生血管密度更高。
2.移植JTMT-MNCs直接参与db/db小鼠HLI模型缺血后肢中新生血管生成，并且伴随着血浆中SDF-1及VEGF的表达上调。
3.HG/hypoxia条件下，JTMT-EPCs具有更强的细胞存活能力、管样结构形成能力和TEM，并且能维持HIF-1α/SDF-1/VEGF信号通路，减少氧化应激损伤。
4.HIF-1α-siRNA抑制HIF-1α表达对MT抗氧化应激作用无影响，但MT过表达上调SDF-1/VEGF，保护EPCs功能作用均被抑制。
结论：
过表达MT能够通过维持HIF-1α/SDF-1/VEGF信号通路保护EPCs功能，从而改善糖尿病引起的缺血后血管新生功能障碍。
糖尿病引起内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）功能障碍所导致的血管生成受损是糖尿病缺血性疾病的重要病因。改善EPCs血管生成能力是治疗糖尿病缺血性疾病的重要策略。活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）在糖尿病和糖尿病并发症的发生和发展中起着至关重要的作用。金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一种富含半胱氨酸的蛋白质。作为有效的抗氧化剂，MT可有效清除或淬灭各种ROS。现有的研究中已经证明了MT在糖尿病并发症治疗中的重大潜力，例如内皮特异性过表达MT具有显著的抗糖尿病肾病作用。然而，在糖尿病中，MT对EPCs功能调节、修复内皮方面的影响及机制尚不清楚。本课题旨在探讨内皮特异性过表达MT是否能改善db/db小鼠后肢缺血（Hind LimbIscheamia，HLI）血流恢复和血管新生，并利用高糖（HighGlucose,HG）、缺氧（Hypoxia）模拟糖尿病体内病理环境，探讨内皮特异性过表达MT保护EPCs功能的分子机制。
方法：
1.使用密度梯度离心法从野生型（Wild Type，WT）小鼠和内皮特异性高表达MT（JTMT）小鼠骨髓中分离出MNCs（BM-MNCs）和EPCs（BM-EPCs）进行培养。
2.利用db/db小鼠构建HLI模型并分别尾静脉注射WT和JTMT小鼠BM-MNCs，然后通过血流灌注成像仪（Pericam Perfusion Speckle Imager，PSI）和免疫荧光方法评价db/db小鼠缺血后肢血流恢复和血管新生情况，考察JTMT BM-MNCs的治疗效应。
3.利用蛋白质印迹法技术、免疫荧光染色检测JTMT BM-MNCs中是否直接参与血管新生，减少氧化应激损伤。
4.使用密度梯度离心法从WT和JTMT小鼠骨髓中分离出EPCs进行培养，并鉴定。
5.体外模拟糖尿病HG/hypoxia环境，通过基质胶成管实验、跨内皮迁移实验、细胞流式术，DHE（Dihydroethidium）染色考察MT在对EPCs成管、跨内皮迁移（Transendothelial Migration，TEM）、凋亡及ROS水平的影响。
6.利用蛋白质印迹法技术检测MT是否维持了糖尿病环境下EPCs中的促血管再生信号通路（Hypoxia Inducible Factor-1/Stromal Cell Derived Factor-1/Vascular Endothelial Growth Factor，HIF-1α/SDF-1/VEGF）。
7.利用HIF-1αsiRNA抑制HIF-1α表达，通过蛋白质印迹法、基质胶体外成管实验、跨内皮迁移实验和DHE染色实验，进一步验证MT是否通过维持HIF-1α/SDF-1/VEGF信号通路保护EPCs功能。
结果：
1.与移植WT-MNCs的小鼠相比，移植JTMT-MNCs的db/db小鼠HLI模型后肢血流恢复更快，新生血管密度更高。
2.移植JTMT-MNCs直接参与db/db小鼠HLI模型缺血后肢中新生血管生成，并且伴随着血浆中SDF-1及VEGF的表达上调。
3.HG/hypoxia条件下，JTMT-EPCs具有更强的细胞存活能力、管样结构形成能力和TEM，并且能维持HIF-1α/SDF-1/VEGF信号通路，减少氧化应激损伤。
4.HIF-1α-siRNA抑制HIF-1α表达对MT抗氧化应激作用无影响，但MT过表达上调SDF-1/VEGF，保护EPCs功能作用均被抑制。
结论：
过表达MT能够通过维持HIF-1α/SDF-1/VEGF信号通路保护EPCs功能，从而改善糖尿病引起的缺血后血管新生功能障碍。