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大麻二酚(Cannabidiol,CBD)是植物大麻中的主要大麻素之一,具有抗肿瘤活性,毒副作用较小,已在加拿大获得化疗辅助用药批准。我们研究了 CBD对白血病细胞系K562细胞的作用效果,发现多种剂量的CBD可致细胞发生以出泡形式的死亡,并选定50 uM的CBD进行研究。为了鉴别CBD引起的死亡方式,我们观察了小分子抑制剂Necrostatin-1和Z-VAD-FMK对CBD杀伤白血病细胞的影响,发现RIPK1的抑制剂Necrostatin-1抑制死亡的效果优于Caspase抑制剂Z-VAD-FMK,提示CBD诱导细胞发生程序性细胞坏死。胞内活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)在CBD诱导细胞死亡过程中表现为先上升后下降的趋势。我们在三种白血病细胞系K562,HL-60及CEM/C1中观察到抗氧化酶Tempol可延缓CBD的杀伤作用,且6h时死亡细胞的比例为K562>CEM/Cl>HL-60。接下来,我们以CM-H2DCFDA染料定量检测了三种白血病细胞内源性ROS水平,发现K562>HL60>CEM/C1。利用叔丁基过氧化氢(Tert-butyl hydroperoxide,TBHP)处理白血病细胞,令细胞产生氧化应激反应后定量胞内ROS水平,发现K562>CEM/C1>HL60,与CBD处理后细胞发生程序性死亡的速率一致,提示CBD处理后细胞发生程序性死亡与其维持氧化还原稳态的能力成反比。转录组数据提示CBD处理激活了胞内TNFα通路,可能是激活细胞程序性坏死的主要通路。以上信息提示,CBD激活TNFα通路并升高了细胞内ROS水平,从而引起白血病细胞发生程序性细胞坏死,该机制有待进一步研究,以为CBD作为抗白血病新药研发奠定理论基础。敲低基因的表达水平是研究基因功能的常用手段,为了探究KRAB-dCas9蛋白和sgRNA的表达水平对CRISPRi系统敲低效率的影响,我们通过慢病毒转导和流式细胞术的方法获得了持续型(SFFV启动子)和诱导型(Tet-on系统)表达KRAB-dCas9蛋白的K562单克隆细胞株。随后,我们从hCRISPRi-v2和Dolcetto两个文库中随机选择了 6个基因的sgRNA用于验证4个单克隆细胞株的敲低功能,并应用流式细胞术定量了细胞内KRAB-dCas9蛋白与sgRNA的表达水平。结果显示,细胞内表达足够高的KRAB-dCas9蛋白是CRISPRi系统获得有效敲低效率的前提,在高表达KRAB-dCas9蛋白的K562-dCas9#B细胞中,mmaadhc,rpia,znf148基因的敲低效率分别为74.72%,72.28%,39.08%。随后,我们通过慢病毒转导不同感染复数(Multiplicity of infection,MOI)的sgRNA慢病毒颗粒来调控sgRNA的表达水平,结果显示CRISPRi系统的敲低效率与sgRNA表达水平线性相关。对CRISPRi系统敲低效率的数据运用线性回归模型分析显示,sgRNA的表达水平对CRISPRi系统敲低效率的影响显著优于KRAB-dCas9蛋白的表达水平。以上信息提示当细胞内表达足够高的KRAB-dCas9蛋白时,sgRNA的表达水平是影响CRISPRi效率的主要因素。