研究背景:胃癌(gastric cancer,GC)是最常见的恶性肿瘤之一。根据CA杂志2018年发布的最新全球癌症统计数据,全球约有103.3万例新发胃癌病例,约有78.2万人死于胃癌,分别位于恶性肿瘤发病率第7位、死亡率第3位。近一半的新发胃癌病例和超过一半的死亡病例集中在东亚地区,主要发生在中国、日本和韩国。中国是一个胃癌高发的国家,2015年中国新发胃癌病例数约为67.9万例,死亡病例数约为49.8万例,中国的胃病病例数和死亡病例数分别占全球的42.6%和45%。其中,发病率居世界第5位,死亡率居第6位,发病人数和死亡人数均居世界第1位。我国胃癌的预后较差,疾病负担较重,严重威胁着人民群众的生命和健康,是肿瘤防治的重点。在胃癌尤其是晚期胃癌的综合治疗中,化疗是非常重要的治疗手段之一。虽然化疗药物己取得巨大进展,但是在临床实践中,化疗耐药时常发生,并已成为胃癌治疗失败的重要原因之一。大多数胃癌患者在诊断时就已经存在广泛浸润、淋巴结转移和化疗耐药,这些是导致胃癌的预后不良和生存率较低的主要因素。胃癌化疗有限的疗效和相当大的毒性促使人们寻求新的全身治疗策略。肿瘤化疗耐药性的产生可能是多种因素和多种机制相互作用的结果。肿瘤药物耐药主要是由多种因素引起的,其中包括肿瘤患者的个体差异,肿瘤本身的遗传学差异。化疗药物耐药机制常见的原因是细胞膜药物转运蛋白的表达丢失或突变;细胞表面药物特定靶点突变;药物诱导的细胞凋亡受到抑制;DNA损伤修复功能增强;药物代谢解毒和代谢活化发生改变;肿瘤微环境发生改变。虽然对于影响化疗耐药的作用机制等方面,目前已经进行了许多研究,但是至今对于胃癌的发生和发展的分子遗传机制以及胃癌耐药的详尽机制尚不完全清楚。对于胃癌化疗耐药的调节因素仍然知之甚少。胃癌的化疗耐药一直是困扰临床胃癌治疗成功的巨大障碍。如果能够阐明胃癌耐药机制,将会极大的帮助制定肿瘤治疗策略以及促进新药的研发,从而改善胃癌生存率及患者的生活质量。因此对于胃癌耐药的机制研究具有重大意义,是重要的研究课题。转录因子TAp73是一种具有转录激活能力的p73蛋白,在结构和功能上与p53高度相似性,因此TAp73 一直被认为是恶性肿瘤治疗的候选靶点。但是,因为在多种恶性肿瘤研究中发现TAp73高表达,TAp73究竟是抑癌基因还是致癌基因,仍有争议。因此我们想探究TAp73在胃癌的作用,尤其是在化疗耐药中的作用如何。本实验通过应用多个胃癌细胞系,如AGS、SNU-1和SNU-3研究TAp73的表达状况,并揭示TAp73过表达如何影响化疗药物耐药及机制。此外,我们还探讨了TAp73过表达如何影响裸鼠肿瘤组织细胞凋亡以及对于裸鼠体内肿瘤的影响。研究目的:本课题以AGS、SNU-1和SNU-3人胃癌细胞系为研究对象,并通过构建人胃癌5-氟尿嘧啶耐药细胞系以及过表达TAp73及干扰转染细胞系,通过体外及体内实验,对TAp73基因参与调控胃癌5-氟尿嘧啶化疗耐药机制进行深入探讨,希望能够筛选出化疗耐药的预测指标,从而更好地选择化疗治疗的目标人群,为下一步逆转化疗药物耐药的临床研究奠定实验基础。研究方法:1.建立耐药细胞系及耐药特征分析:采用逐步增加药物剂量方法诱导构建对5-氟尿嘧啶耐药的人胃癌细胞系。2.利用MTS法和流式细胞术分别对细胞活力和凋亡率进行检测。3.利用RT-qPCR和Western blot实验检测TAp73及其下游相关转录基因Bax、Noxa的表达以及上游调控基因E2F1的表达。4.建立TAp73过表达、E2F1过表达及干扰稳定转染AGS细胞:通过质粒转染构建TAp73过表达、E2F1过表达、E2F1 siRNA及其对照空载体稳定转染AGS细胞,检测TAp73过表达、E2F1过表达、敲低E2F1表达对于胃癌细胞耐药的影响。5.免疫共沉淀检测胃癌细胞中TAp73与E2F1的关系。6.裸鼠成瘤模型:将TAp73过表达及其对照组空载体转染AGS细胞,采用皮下注射方法进行裸鼠皮下成瘤,构建裸鼠胃癌成瘤模型,并分别予以PBS、5-氟尿嘧啶给药干预成瘤裸鼠;定期观察测量肿瘤体积,并绘制肿瘤生长曲线;分别利用Western blot、RT-qPCR等方法,检测肿瘤组织TAp73及其下游相关转录基因Bax、Noxa的蛋白表达和mRNA表达水平;通过TUNEL染色检测肿瘤组织细胞凋亡情况。结果:1.5-氟尿嘧啶抑制胃癌细胞TAp73的表达5-氟尿嘧啶抑制胃癌细胞TAp73的表达,激活caspase-3,显著诱导胃癌细胞的凋亡。这表明TAp73可能对于5-氟尿嘧啶诱导胃癌细胞凋亡过程起到重要作用。2.改变TAp73表达影响5-氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡及下游靶基因的表达转染TAp73质粒后,TAp73过表达可抑制5-氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡。并且抑制了下游参与细胞凋亡的靶基因Bax、Noxa的表达,这些结果表明,TAp73可能通过抑制p53的下游基因Bax、Noxa来影响5-氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡。3.E2F1是TAp73的上游调节因子,通过调节TAp73表达影响细胞凋亡E2F1在胃癌细胞中的表达被5-氟尿嘧啶所抑制;E2F1与TAp73启动子的CHIP结合测定结果显示,5-氟尿嘧啶可阻碍E2F1与TAp73启动子的结合。此外,通过E2F1转染AGS细胞,E2F1过表达后TAp73蛋白表达增加,caspase-3表达降低,5-氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡受到抑制。因此,这些结果共同表明,E2F1是胃癌细胞TAp73的上游调节因子,调控TAp73的表达,进而影响5-氟尿嘧啶所诱导的细胞凋亡。4.TAp73和E2F1高表达,促进了胃癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药我们使用AGS细胞系通过连续多轮逐渐增加5-氟尿嘧啶剂量方法诱导建立5-氟尿嘧啶耐药细胞系。通过对耐药细胞耐药特征分析,我们所构建的耐药细胞对5-氟尿嘧啶具有耐药性,耐药细胞构建成功。在耐药细胞中5-氟尿嘧啶并不能抑制E2F1和TAp73的表达。与亲本细胞相比,耐药细胞caspase-3的活化和细胞凋亡均降低。然而,对耐药细胞转染siRNA敲低E2F1表达后,耐药细胞恢复了对于5-氟尿嘧啶的敏感性,caspase-3活化增加,及细胞凋亡增加。且E2F1在AGS耐药细胞中的半衰期要远远长于亲本细胞。这些结果表明,TAp73和E2F1在胃癌细胞对于5-氟尿嘧啶耐药中起到重要作用,E2F1通过调控TAp73的高表达抑制了胃癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性。5.裸鼠皮下成瘤模型证实,TAp73的高表达促进了5-氟尿嘧啶耐药通过TAp73过表达和对照细胞成功构建胃癌裸鼠皮下成瘤模型,并分别行5-氟尿嘧啶和PBS给药处理成瘤裸鼠。测量肿瘤体积,结果显示:①对于TAp73过表达裸鼠,5-氟尿嘧啶给药组与PBS组比较,肿瘤体积无显著差异。②对照空载体质粒转染裸鼠,5-氟尿嘧啶给药组肿瘤体积显著低于PBS组。③对于5-氟尿嘧啶给药的裸鼠,对照空载体质粒转染组肿瘤体积显著小于TAp73过表达组。④对于PBS给药的裸鼠:即使TAp73过表达,肿瘤大小没有明显差异。此外,TAp73过表达后5-氟尿嘧啶引起的肿瘤凋亡TUNEL信号明显降低,以及caspase-3的活化水平降低。同时在裸鼠肿瘤组织中也证实TAp73过表达抑制了Bax和Noxa的表达水平。裸鼠体内实验证明TAp73高表达促进5-氟尿嘧啶耐药。结论:1.TAp73参与调控胃癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药。2.TAp73通过调控下游靶基因Bax、Noxa来影响5-氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡。3.E2F1是TAp73的上游调节因子,TAp73的表达受到E2F1的调控,从而影响胃癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药。