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目前临近枯竭的传统化石燃料及日益恶化的环境问题,致使生物能源越来越得到广泛关注,其中藻类生物能源也受到各国科学家的重视。微藻含油量高、生物量高、材料易培养和采收、不占用耕作用地等,可以利用现代生物技术强化微藻脂质代谢途径、增加微藻的含油量来提高微藻产油的竞争力。其中莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是遗传背景清晰的真核单细胞藻类,是应用于微藻研究中有关生物燃料研究领域的模式藻,更是研究油脂代谢基因的理想受体藻。甘油-3-磷酸脱氢酶基因(gpd1)可以调控植物脂质代谢中关键酶甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)的活性,能促进植物脂质合成,同样也决定莱茵衣藻代谢中甘油三酯(TAG)的合成。借助外源gpd1基因提高莱茵衣藻TAG含量,有助于完善莱茵衣藻TAG调控的相关通路和其脂质积累条件的摸索。研究表明在细胞壁缺陷型微藻中过表达外源gpd1基因可以提高藻细胞的油脂含量,但是所选的细胞壁缺陷型藻株材料造成了gpd1基因的过表达研究的局限性。基于此,本研究通过农杆菌介导法在常规莱茵衣藻(有细胞壁)中过表达gpd1基因,来提高藻细胞油脂含量。实验中克隆酵母gpd1基因,构建莱茵衣藻的农杆菌双元表达载体pRI-Ble-GPD1,以莱茵衣藻(藻株:FACHB-479)为受体,通过农杆菌介导法将gpd1基因转移到FACHB-479基因组,经过筛选培养、PCR及RT-PCR分子生物学鉴定获得转基因藻株,其中油脂含量可以增高。所取得的具体研究结果如下:1.优化了莱茵衣藻FACHB-479实验室培养体系:TAP培养基,2000 Lx、25±2℃,每天数次100rpm震荡5min,培养5d可以达到对数生长期,且不凝集;进行1:1000传代扩大培养,藻细胞生长旺盛。2.本研究构建了适用于应用农杆菌介导法转化莱茵衣藻FACHB-479的带有外源酵母gpd1基因的双元表达载体pRI-Ble-GPD1:经过酵母gpd1基因的PCR获得,重组克隆载体pMD-GPD1的构建,重组中间载体pDBle-GPD1的构建,表达载体pRI-Ble-GPD1的构建四步构建出表达载体。之后冻融法转化到农杆菌LBA4404的感受态细胞,并通过Amp(100μg/mL)抗性的YEB平板筛选得到阳性LBA4404,可以携带外源酵母gpd1基因,用于衣藻的转化。3.通过农杆菌介导法成功转化莱茵衣藻FACHB-479,获得转gpd1基因藻株FACHB-GPD:衣藻载体pRI-Ble-GPD1携带gpd1基因,经农杆菌介导转化FACHB-479细胞,历经共培养48h,Zeocin(10pg/mL)抗性的TAP固体筛选培养5 d,可以收获到阳性转化藻;PCR和RT-PCR检测目标条带1175 bp存在,目的gpd1基因在转基因FACHB-GPD顺利整合和表达。4.优化了尼罗红染色法检测莱茵衣藻油脂的方法:使用终浓度40 mg/L的尼罗红一甲醇溶液,23℃,避光染色15 min,莱茵衣藻细胞中脂滴荧光效果好。5.转gpd1基因藻FACHB-GPD的油脂含量提高:尼罗红染色藻细胞,多功能酶标仪荧光分析法检测,转gpd1基因藻FACHB-GPD中油脂含量增高,提高到野生型莱茵衣藻FACHB-479的1.3～1.52倍。