研究背景:胃癌（gastric cancer,GC）是我国最常见的消化系统肿瘤,化疗目前仍然是中晚期患者最主要的治疗手段之一。临床中发现,患者在第二、三个化疗周期后会出现疗效逐渐减弱,原因可能在于此时肿瘤细胞对化疗抵抗不断增强,最终会导致化疗耐药,发生复发转移。研究表明化疗药物进入肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）后不仅仅杀伤肿瘤细胞,同时会对周围的基质细胞,如肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast,CAFs）造成损伤,而CAFs会因此进入衰老状态,同时产生衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype,SASP）等增强肿瘤细胞的干性,并抑制肿瘤微环境内的免疫细胞功能,从而引起化疗抵抗,最终导致耐药发生。CAFs是TME中最多的基质细胞,其来源多由正常的成纤维细胞诱导转化而成,而TME中过多的TGF-β激活其SMAD通路是完成转化的重要机制。相比于正常的成纤维细胞,CAFs拥有更强的分泌功能,会释放更多的促瘤因子,当其遭受化疗损伤后,衰老状态CAFs分泌谱随之发生改变,在激活的核转录因子κB（NF-κB）与P38MAPK通路的调控下,产生了包含IL-6、IL-8、Wnt16B等的SASP。Wnt16B是Wnt/β-catenin通路的配体,该通路的激活可提高癌细胞干性水平,表达干性化表型。CD44是目前公认的癌干细胞标志物之一,高表达CD44的胃癌细胞具有更强的致瘤能力、迁移能力,而CD44正是Wnt/β-catenin通路的下游靶基因。此外,乙醛脱氢酶家族（acetaldehydedehydrogenase,ALDH）成员ALDH1A3是最近在胃癌中新被发现的一种干细胞标志物,在胃癌最常用的化疗药物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）抵抗的胃癌细胞中高表达,同样与Wnt通路激活相关。干性化的癌细胞有更强的侵袭能力,同时也强化了免疫逃避,表面高表达人类白细胞抗原-E（human leukocyte antigen-E,HLA-E）,抑制NK细胞的杀伤功能可能是其逃避清除,持续增殖,并最终加重化疗抵抗的关键原因。扶正解毒方是广安门医院肿瘤科治疗胃癌的有效方。前期研究表明该方联合化疗能够提升患者化疗效果,基础研究上证实扶正解毒方抑制肿瘤细胞增殖的同时可以下调荷瘤小鼠血清TGF-β水平,抑制肿瘤血管生成。我们近期的研究发现:细胞中化疗损伤产生的DNA片段会激活环磷酸鸟苷-腺苷合成酶（cGAS）,在识别胞质中内源性DNA后通过激活NF-κB,释放SASP激活癌细胞的Wnt/β-catenin通路,提升癌细胞胞质内β-catenin积累促进癌细胞干性化。但扶正解毒方是否调控了 TGF-β/SMAD介导的CAFs的形成、干预了 CAFs的衰老和衰老分泌、减少了癌细胞干性表型、提升了NK细胞的杀伤能力尚未完全清晰,故本研究采用体内、外实验相结合,首先验证扶正解毒方在CAFs形成中的作用,其次对于CAFs衰老的调控,然后探究是否干预衰老CAFs分泌对胃癌细胞干性化的作用,另外观察对NK细胞杀伤干性化癌细胞的协同作用,从TME中“肿瘤细胞—基质细胞—免疫细胞”相互作用的角度,进一步探究“CAFs形成—化疗后衰老分泌—癌细胞干性化—抑制NK避免清除”途径对化疗抵抗发生发展的影响及扶正解毒方的干预作用,助力解决胃癌化疗耐药的临床瓶颈问题。研究目的:1.构建CAFs模型、衰老CAFs分泌模型、同时采用衰老条件培养基（conditionedmedium,CM）诱导癌细胞干性化、干性化癌细胞/NK细胞共培养体系,从体外观察扶正解毒方含药血清干预TGF-β1/SMAD2/3介导CAFs形成通路,P38MAPK介导的衰老分泌通路,癌细胞干性表型形成途径、NK细胞失能形成途径的多角度干预作用。2.构建衰老CAFs/癌细胞混合荷瘤免疫缺陷小鼠模型,从体内观察扶正解毒方提升化疗疗效,验证调控“CAFs形成—化疗后衰老分泌—癌细胞干性化—抑制NK避免清除”改善化疗抵抗的可能途径。研究方法:1.CAFs模型构建及扶正解毒方干预作用机制探究采用TGF-β1体外诱导人胚肺成纤维细胞（MRC-5）作为CAFs,使用CCK-8检测其增殖能力,细胞免疫荧光检测CAFs标志物α-SMA、FAP表达,ELISA法检测CAFs分泌IL-6、SDF-1α、TGF-β1能力,RT-PCR法检测扶正解毒方对CAFs形成通路SMAD mRNA影响,Western blot法检测扶正解毒方对CAFs的SMAD2/3通路及FAP、α-SMA表达影响,同时评估扶正解毒方通过调控TGF-β1/SMAD2/3通路在CAFs形成中的作用。2.衰老CAFs模型构建及扶正解毒方干预机制研究比较5-FU、过氧化氢诱导CAFs衰老模型,使用β-半乳糖苷酶染色确定模型构建成功,并用CCK-8法、Annexin-V/PI法评估模型稳定性。过氧化氢诱导衰老模型确定后,使用扶正解毒方含药血清干预,采用β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞比例,流式细胞术检测衰老细胞HLA-E表达、RT-PCR、Western blot法检测细胞周期蛋白、衰老相关p38 MAPK通路表达来评估扶正解毒方调控CAFs衰老的作用。3.扶正解毒方对衰老CAFs-CM所致癌细胞干性化干预机制探究。采用CAFs衰老模型制备条件培养基（Conditionedmedium,CM）培养人胃癌细胞（MKN-45）,并用CCK-8法测定条件培养基培养后MKN-45（CM-MKN-45）的增殖能力,划痕实验、克隆形成实验、Transwell侵袭实验评估CM-MKN-45的恶性行为,RT-PCR、Western blot法检测干性化相关的SOX2、CD44、ALDH1A3、LGR-5表达,同时使用扶正解毒方含药血清干预,评估扶正解毒方在抑制肿瘤细胞干性形成中的作用。4.扶正解毒方提升NK细胞对衰老CAFs-CM诱导干性化癌细胞杀伤能力机制研究以效应细胞（NK-92细胞）和靶细胞（衰老CM-MKN-45）为研究对象,首先通过CCK-8法确定扶正解毒方含药血清对NK-92的最佳干预浓度、干预作用,选择两种细胞的最佳效靶比,之后采用乳酸脱氢酶（LDH）法测定NK-92细胞杀伤活性,通过ELISA法检测NK-92细胞IFN-γ的释放水平,流式细胞术检测NK-92细胞CD107a的表达量来观察脱颗粒能力。此外,建立Transwell小室共培养体系,观察衰老CM-MKN-45与NK细胞间识别受体、功能受体的影响,流式细胞术检测衰老CM-MKN-45表面激活性MICA/B与抑制性HLA-E受体的表达,NK-92细胞功能受体NKG2A、NKG2D的表达,同时使用扶正解毒方含药血清干预,评估扶正解毒方在增强NK细胞杀伤干性化胃癌细胞中的作用。5.扶正解毒方对衰老CAFs—胃癌细胞混合接种小鼠模型干预作用及NK功能调控机制研究。通过将衰老CAFs与MNK45混合接种于免疫系统仅有NK细胞、单核细胞的CB17-SCID小鼠来构建荷瘤小鼠模型,设置对照组、单纯扶正解毒方组（中药组）、化疗组以及扶正解毒方+化疗组（中药+化疗组）,来观察扶正解毒方改善化疗抵抗的作用,并通过测量肿瘤体积、瘤重、脾重,瘤组织免疫组化染色、ELISA检验血液炎性因子、流式细胞术检测NK细胞比例、Western blot法检测干性化指标来验证相关机制。研究结果:1.CAFs模型构建及扶正解毒方干预作用机制探究10ng/mLTGF-β1干预24h的MRC-5可以诱导CAFs形成,扶正解毒方可以降低其特征性标志物α-SMA、FAP的表达,下调了其特征性TGF-β1、IL-6以及SDF-1α促瘤因子的水平,抑制肿瘤微环境中的CAFs形成,其机制与抑制了 TGF-β1/SMAD2/3通路激活相关。2.衰老CAFs模型构建及扶正解毒方干预机制研究60μM过氧化氢干预24h构建成功CAFs衰老模型,扶正解毒方可以抑制肿瘤微环境中的CAFs的衰老,机制与下调了细胞周期p16、p21的表达相关,同时扶正解毒方抑制了 P38MAPK通路的表达,进一步阻止衰老的发生、衰老相关的分泌以及衰老微环境的形成。3.扶正解毒方对衰老CAFs-CM所致癌细胞干性化干预机制探究。衰老CAFs-CM可以促进MKN-45细胞干性化,表现更强的增殖、迁移、侵袭能力,表达更高水平的干性化标志物。扶正解毒方可以抑制肿瘤微环境中的衰老CAFs-CM诱导的癌细胞干性化,显著降低干性化癌细胞的增殖、迁移、侵袭等恶性行为,其机制与抑制Wnt/β-catenin下游最普遍干性化标志CD44、胃癌较特异干性化标志ALDH1A3、5-FU较特异干性化标志LGR-5表达相关,同时也降低了此通路之外较原发性干性标志SOX2的表达,说明了扶正解毒方可以降低多种因素诱导的癌细胞干性化表达,阻止化疗抵抗形成。4.扶正解毒方提升NK细胞对衰老CAFs-CM诱导干性化癌细胞杀伤能力机制研究NK-92细胞对MKN-45胃癌细胞有杀伤能力,最佳能力发挥的效靶比在5:1,扶正解毒方含药血清可以提升NK-92细胞的杀伤效率,最佳的干预浓度为10%;衰老CAFs-CM环境对NK细胞有抑制作用,扶正解毒方可以恢复NK细胞的杀伤能力;NK细胞对衰老CAFs-CM诱导下MKN-45有杀伤能力,扶正解毒方可提升NK细胞直接的细胞毒作用、分泌抗肿瘤因子、脱颗粒的杀伤能力;衰老CAFs-CM诱导下MKN-45会高表达HLA-E结合NK细胞抑制性受体NKG2A,扶正解毒方可以抑制此过程,并上调癌细胞MICA/B结合NK细胞的激活性受体NKG2D引起杀伤。5.扶正解毒方对衰老CAFs—胃癌细胞混合接种小鼠模型干预作用及NK功能调控机制研究。衰老CAFs与MKN-45混合皮下接种可在CB17 SCID小鼠上100%成瘤;扶正解毒方联合化疗可以减轻混合荷瘤小鼠瘤重,显著减小肿瘤体积,相较于化疗组有着更高的抑瘤率,同时降低了 ALDH1A3与CD44这两种癌细胞干性化标志物的表达,降低了 α-SMA的表达抑制了 CAFs的形成,另外对NK细胞比例和功能也有一定提升,证实了扶正解毒方通过抑制化疗中CAFs诱导癌细胞干性化,增强NK细胞功能,减轻化疗抵抗形成的作用。研究结论:1.扶正解毒方体外、体内均具有良好的化疗增效作用,可降低肿瘤组织中CAFs形成、癌细胞干性化程度,并且对NK细胞比例和功能有一定的提升,减少了化疗抵抗的发生。2.扶正解毒方可通过抑制TGF-β1/SMAD2/3通路介导的CAFs形成,调控细胞周期及衰老相关通路p38MAPK抑制CAFs衰老,下调衰老CAFs-CM促进的MKN-45的干性形成并提升NK清除能力,调控癌细胞、NK细胞受配体增强对干性化MKN-45杀伤能力。3.结合以上研究显示:胃癌化疗患者存在“正虚毒伏”的病机,其中“正虚”可能与NK细胞失能相关,“毒伏”可能与化疗后干性化癌细胞化疗抵抗相关,扶正解毒是主要的治则。扶正解毒方可以调控TME中“肿瘤细胞—基质细胞—免疫细胞”相互作用,抑制“CAFs形成—化疗后衰老分泌—癌细胞干性化—抑制NK避免清除”途径,可能是有效降低化疗抵抗发生新的作用机制。