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本文主要对乌鸡的可控酶解、酶解动力学及其水解产物的离子交换分离进行了研究,并对蛋白水解物制备过程中分子量的变化以及与抗氧化活性的关系进行了分析。
在可控酶解乌鸡肉糜的研究中,因木瓜蛋白酶肽得率是各酶中最高,水解液清亮,确定所用水解酶为木瓜蛋白酶。通过pH值、时间、温度、酶用量、底物浓度以及是否添加酶的激活剂等单因素试验,确定水解过程中不必加碱恒定体系pH,时间为3h,在酶解过程中不需添加半胱氨酸及EDTA等激活剂。利用SAS软件,通过RSM对酶解工艺进行优化,得影响肽得率二次多项式模型为:Y1=71.73+0.37X1+1.09X2+0.23X3-1.30X12-0.15X1X2-0.31X1X3-0.85X22-0.03X2X3-0.59X32温度(X1)、酶用量(X2)对肽得率影响显著,底物浓度(X3)则不显著。对回归方程求导可求得最佳点并考虑实际操作,确定酶解的最佳条件为温度70℃、酶用量为4600U/g,底物浓度为5.8%,肽得率达71.92%。
木瓜蛋白酶热失活符合一级失活模型,在不同温度下的热失活常数随温度的升高而升高,服从阿伦尼乌斯(Arrhenius)方程,并通过计算得出50℃到90℃范围内热失活过程活化能Ea为49.94KJ·mol-1,及不同温度下酶活半衰期t1/2、热力学函数。通过L-B作图得木瓜蛋白酶酶解乌鸡蛋白的米氏常数Km=5.70×10-3mol/L。在考虑底物及产物对酶有抑制情况下,通过试验及经验公式得木瓜蛋白酶可控酶解乌鸡肉糜动力学模型分别为:DH=10.309ln[1+(1.694E0/S0+0.012)t]和r=(17.461E0+0.1248S0)exp[-0.097(DH)],并可求出酶的催化常数(Kcat)为17.461min-1,底物及产物抑制酶失活的抑制常数(Ki)为1.5898min-1。
通过分析不同时间乌鸡酶解产物肽组分得知,分子量8000Da以下的肽约占80%,1000Da以下约占30%,主要集中在11000Da,6500Da,2000Da、1200Da以及137Da附近,6h后酶解物对O2-清除能力最强,而1h及4h后的酶解物对·OH清除能力最强。肉鸡木瓜蛋白酶水解物的GPC图谱与乌鸡酶解物类似,但乌鸡酶解产物小分子肽含量比肉鸡酶解产物多,乌鸡酶解产物清除O2-的能力比肉鸡酶解产物高50.26%,但清除·OH的能力要比普通肉鸡酶解产物低10.03%。通过多酶分步酶解可知,乌鸡蛋白酶解产物的多样性主要由第一种酶即木瓜蛋白酶所决定,Protamex对木瓜蛋白酶水解产物的继续酶解有利于O2-清除能力的提高,Flavorzyme对O2-与·OH的清除能力均不利。
离子交换法的研究表明,合适离子强度的初始缓冲液、上样量及恰当盐浓度的洗脱剂有利于提高交换容量和分离效果。通过试验确定两浓度三步洗脱法实现酶解液肽组分的分离。与肉鸡酶解液对比,乌鸡蛋白酶解液可洗脱出6个峰,通过肽含量的测定,可确定为四部分,而肉鸡蛋白酶解液只能确定为三部分,且肉鸡酶解液中带有较多负电荷肽的比例更高。在抗氧化活性分析试验中,从乌鸡酶解液分离得到的峰5清除O2-与·OH的能力都为最高。