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鹅细小病毒病,俗称“小鹅瘟”,是危害雏鹅的一种主要疫病,流行于世界上主要的养鹅国家,具有很高的发病率和死亡率。该病病原为鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）,目前归为细小病毒科依赖病毒属。目前,对GPV致病的分子机理的认识还很不清楚,这与GPV不能在体外培养的细胞上良好增殖不无关系。GPV强毒株在鹅胚上能够很好的复制并能致死鹅胚,但却不能在鹅胚成纤维细胞中良好增殖,这也限制了深入探究GPV与宿主细胞蛋白之间的互作关系。本研究旨在培育一株能够在鹅胚成纤维细胞上增殖良好的适应株,并对细胞适应的分子基础进行了分析揭示,为今后深入探索GPV复制及致病的分子机制奠定了基础。一、鹅细小病毒鹅胚成纤维细胞适应株的培育SYG61v是一株对鹅胚高度适应的GPV弱毒疫苗株。为了在尽可能短的传代时间内培育出对GEF高度适应的GPV毒株,本研究以SYG61v作为传代的起始亲本株,在GEF原代或次代细胞上连续盲传40代次。研究结果显示,SYG61v病毒株传代至40代次,已经能很好的适应GEF,感染后72h,GEF上已经可以观察到明显的细胞病变（CPE）,表现为胞质内颗粒物增加、细胞肿胀、边界粗糙,直至崩解脱落。为区分于传代前的亲本株SYG61v,对传代至40代次的病毒用SYG61v-C40表示。以Rep蛋白多克隆抗体介导的间接免疫荧光（IFA）显示,在接种细胞适应株之后72h,在细胞核内可以检测到明亮的荧光,而对照组GEF无荧光信号。绝对荧光定量PCR显示,在20代次的细胞裂解物中,病毒基因组拷贝数可达到最高水平,约2.4×109/ml,并在随后代次中略有下降,维持在约5.4×108/ml水平。对SYG61v-C40适应株的组织细胞半数感染量（TCID50）测定表明,其TCID50达到2×106.69/ml。为了进一步评价适应毒对雏鹅及鹅胚的致病性,将SYG61v-C40细胞裂解液与其亲本病毒SYG61v分别接种9日龄易感鹅胚和2日龄雏鹅。结果显示,SYG61v-C40接种的9个易感鹅胚,平均死亡时间达211h,而SYG61v接种的鹅胚在97h即可致死全部鹅胚,表明SYG61v-C40对鹅胚的致病力已经明显下降。对SYG61v-C40接种的雏鹅无一死亡,其7天和21天的体重分别达到0.258 kg和0.657 kg,略低于同期对照组的体重0.288 kg和0.690 kg,但统计学差异不显著,表明SYG61v-C40细胞适应株对雏鹅仍表现为轻微的致病性。二、GPV鹅胚成纤维细胞适应株SYG61v-C40基因组定序和比较分析SYG61v-C40细胞适应株基因组中哪些元件的改变与细胞适应性转变相关尚不清楚。本研究对SYG61v-C40的基因组分段进行了 PCR扩增、克隆和测序,通过拼接获得了 SYG61v-C40的基因组序列,进而通过与亲本病毒SYG61v之间展开比较,得以明确哪些核苷酸或氨基酸改变与细胞适应性相关。研究结果显示,在SYG61v-C40株编码蛋白区共有13个核苷酸发生了点突变,其中3个位于Rep基因,10个位于VP1基因,共导致6个氨基酸位点发生突变,其中1位于Rep蛋白羧基端,5个位于结构蛋白VP1部分。进一步分析显示,产生于VP1蛋白中的5个突变氨基酸,107和142位氨基酸位于VP1的N端独特区（VP1u）,而该区域被认为具有磷脂酶活性,与细小病毒的感染密切相关。381和449位氨基酸则位于VP3蛋白,分别由天冬酰胺变为赖氨酸（N→K）、丝氨酸变为精氨酸（S→R）。这两个氨基酸突变不仅改变了氨基酸极性,而且其位点还处于衣壳外表面,因而对SYG61v-C40株细胞适应性的转变可能具有关键性影响。SYG61v-C40的ITR回文区茎部缺失34个碱基,这些缺失碱基均处于回文区茎部外侧。应用核酸二级结构分析软件分析显示,SYG61v-C40株ITR回文区茎部由于碱基缺失多出了 1个loop结构。由于ITR不仅是基因组复制起点,还参与转录、病毒子组装等过程,这种ITR二级结构的改变对SYG61v-C40株细胞适应性的建立具有何种作用有待深入分析。三.SYG61v-C40株细胞株突变氨基酸位点的功能分析SYG61v-C40尽管经历了 40次的GEF传代,与其亲本株SYG61v相比,SYG61v-C40累积的核苷酸突变很有限,由此产生的突变氨基酸位点只有6个,而ITR中,除了几个核苷酸突变位点外,一个鲜明的特征是在回文区的茎部区域非对称性的产生了 34个碱基缺失,由此与亲本株SYG61v相比,SYG61v-C40 ITR的二级结构中会多出一个loop。那么,编码蛋白中的核苷酸突变和ITR的碱基变动在细胞适应上是否具有不同的地位是本研究的关注问题。通过基于SYG61v的感染性克隆质粒pSYG61v,构建了整合SYG61v-C40编码区序列的嵌合质粒pSYG61v-C40,转染GEF并拯救出感染性病毒。结果显示,拯救出的嵌合病毒pSYG61v-C40感染GEF后72h,GEF就产生细胞崩解等CPE,与细胞适应株SYG61v-C40感染GEF细胞的表现极为类似。而pSYG61v拯救出的病毒感染GEF细胞,直至96 h也不会产生明显CPE。TCID50测定也表明,嵌合病毒pSYG61v-C40的TCID50达到了 2×108.615/ml。绝对荧光定量PCR测定也显示,pSYG61v-C40感染GEF后96 h收获细胞裂解液中能够检出的病毒基因组拷贝数稳定在108～109/ml左右。这些结果表明,SYG61v-C40株之所以能够高度的适应GEF,Rep-VP1编码框中产生的6个氨基酸点突变在其中应该发挥了关键作用。