盖塔病毒（GETV,Getah virus）为披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Alpha virus）的虫媒病毒之一,能以蚊为中间宿主,传染脊椎动物,并引起某些动物的自限性疾病。GETV主要侵害猪和马,造成母猪繁殖障碍,妊娠母猪流产、死胎或弱仔;马感染GETV后会出现体温升高、后肢肿大及淋巴结增大等症状。近年来,我国已在多个地区的蚊虫和猪体内分离到GETV,且某些省份的猪场中GETV的抗体阳性率持续上升。GETV对我国的养猪业已造成一定经济损失。目前,关于GETV的研究还较少,其致病机理尚不明确。因此,本研究开展GETV的病原学研究,从病毒生长特性、疫苗载体功能和蛋白功能等方面进行探究。①对GETV在多种常规传代细胞上的生长特性进行了检测。②为鉴定GETV、进行E2和6K蛋白功能的研究,制备了 E2和6K蛋白的单克隆抗体,并对E2单抗进行表位鉴定。③利用反向遗传学技术构建了 GETV HuN1株全长感染性克隆;同时,将绿色荧光蛋白基因（EGFP）插入病毒基因组中不同位点,构建2种重组报告病毒,探究GETV的载体功能;另外,构建6K基因缺失毒株,探究6K蛋白对病毒特性的影响。以上工作都为诊断和研究GETV提供了有力的工具。具体内容如下:1 GETV HuN1株生长特性的鉴定将 GETV HuN1 株分别接种于 BHK-21、Vero、ST、ST-R、PK15、LLC-PK1和HEK293T细胞,连续传代后,对各细胞系上的F1代和最高代的病毒滴度进行测定。结果表明,GETV可以在BHK-21、Vero、ST和ST-R上连续传代并产生细胞病变（CPE）,滴度可达107-108 TCID50/mL;在PK15和LLC-PK1上仅能传代至F4代,之后不再出现CPE。对GETV HuN1株在ST细胞上的生长曲线进行测定,发现GETV HuN1株的滴度在24 hpi达到峰值2×108 TCID50/mL,之后开始下降。2 GETV E2和6K蛋白单克隆抗体的制备为制备GETV E2和6K蛋白的单克隆抗体,将E2基因的亲水区和6K基因的全长序列分别克隆至原核表达载体pCold-TF,并进行蛋白表达。菌体总蛋白经镍柱亲和和切胶纯化后,免疫BALB/c小鼠。3次免疫后,分离小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合。通过IFA法筛选阳性杂交瘤细胞株,各获得1株抗GETV E2和6K蛋白的单克隆抗体,分别命名为9E8（E2）和25C5（6K）,并制备相应的单抗腹水。结果表明,单抗9E8和25C5均可用于间接免疫荧光（IFA）及蛋白免疫印迹（WB）检测,且免疫反应特性良好,25C5还能够进行免疫沉淀（IP）检测。通过WB检测截短的E2蛋白进行表位鉴定,发现9E8的识别表位为66KIRYIAGHD74。单抗9E8和25C5的成功制备与鉴定,为该病毒的分离鉴定、致病机理和蛋白功能等研究奠定了基础。3 GETV感染性克隆的构建及6K蛋白功能的探究（1）本研究利用反向遗传学技术,构建GETV HuN1株病毒感染性克隆。首先,合成含酶切位点的寡聚DNA片段,并插入pACYC-177载体,再依次插入CMV启动子、其他元件和病毒全长基因组片段,得到GETVHuN1株的全长cDNA感染性克隆质粒pAC-GETV。将pAC-GETV转染BHK-21细胞,取上清液接种ST细胞扩大培养,并运用E2和6K单克隆抗体进行IFA鉴定。结果表明,成功拯救GETV重组病毒,将其命名为rGETV-HuN1（以下简称rGETV）。（2）在全长感染性克隆质粒pAC-GETV的基础上,将Overlap PCR获得的26S-EGFP片段分别插入病毒基因组NS4基因和C基因之间或E1基因和3’UTR之间,构建2种含EGFP的GETV重组感染性克隆质粒（pAC-GETV-EGFP/C和pAC-GETV-EGFP/E1）,并拯救 2 种报告病毒（rGETV-EGFP/C 和rGETV-EGFP/E1）。经过荧光观察,这2种报告病毒均在感染细胞中有较高水平的外源基因表达。RT-PCR检测结果表明,选择E1基因与3’UTR之间为插入位点,可使外源基因在病毒传代的过程中遗传稳定性更高。（3）运用同样的方法构建6K完全缺失的GETV感染性克隆pAC-GETV-△6K,并拯救6K缺失毒株（rGETV-△6K）。通过对病毒结构蛋白进行WB检测,发现6K蛋白缺失后对GETV结构蛋白肽链的切割没有明显影响。但是,滴度测定结果表明,6K缺失能明显抑制病毒复制。