小鹅瘟病毒强毒株细胞适应毒的培育及其VP3基因的表达

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采集疑似小鹅瘟(GP)的病死鹅组织,通过鹅胚分离培养,共获得六株病毒,这些病毒不能凝集鸡红细胞,对鸡胚无致死性,在电镜下为20nm左右的球形无囊膜病毒。利用特异性抗小鹅瘟病毒(GPV)单克隆抗体建立的夹心ELISA方法鉴定,确定分离病毒为GPV。该病毒ELD50为10-3.1/0.2ml。将GPV-CZ分离株病毒在鹅胚成纤维(GEF)细胞上盲传,用特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光检测,发现病毒在第9代可以适应GEF,在第10代GEF可以检测到特异性荧光,并且在10代以后可见CPE。用IFA方法测定细胞毒CZ-ca14株感染GEF的最早检出时间为12小时;测定GPV-CZ-ca株第14代的TCID50为10-9.4/0.2ml,进一步对细胞适应毒(命名为GPV-CZ-ca株)的第14代(约109TCID50)和胚毒(103ELD50)进行比较,结果表明GPV-CZ-ca-14对易感雏鹅无致病性,而原代尿囊液胚毒对雏鹅的致死率为100%,说明该病毒在GEF连续传代适应后病毒毒力逐渐减弱;以约109TCID50的量接种无母源抗体的雏鹅,结果表明中和抗体在接种后22天达到最高峰, GPV-CZ-ca株有望作为GPV弱毒疫苗株的候选毒株。以感染GPV-CZ-ca株的鹅胚成纤维细胞的DNA为模板,根据Genbank上公布的B株小鹅瘟病毒的基因序列设计引物,PCR扩增VP3基因,获得的PCR产物克隆入pGEX-6P-1中并转化BL21感受态细胞。阳性菌经鉴定正确后,用IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。结果发现,VP3基因能够在原核大肠杆菌中得到高效可溶性表达。对表达条件优化结果表明,在诱导5小时,用不同IPTG浓度诱导,表达产物均呈高效可溶性表达。用浓缩的小鹅瘟病毒抗原免疫Babl/c小鼠制备GPV多抗,进行WESTERN-BLOT实验,结果证明VP3与GST融合表达的分子量为84kDa。病毒主要结构蛋白VP3在大肠杆菌中的可溶性表达对小鹅瘟病毒的深入研究和免疫防治及免疫诊断工作的开展提供一定的条件。
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