目前,牙髓根尖周病的基本治疗方法是根管治疗术(Root canal therapy,RCT)。由于牙髓炎、根尖周炎主要是由细菌感染所引起的,其治疗成功的关键便在于能否彻底地清创和有效地去除根管内的感染。然而,根管的解剖形态各异,加之目前根管预备和冲洗的局限性,不能彻底的去除根管系统内的全部细菌。残留的细菌能够长期定植生存于根管内,当有营养物质再次进入根管时,如充填材料发生微渗漏,其可大量增殖从而引起持续的再感染。治疗中常可遇到一些经多次治疗后症状无改善或仍反复发作的难以治愈的慢性根尖周炎病例,临床上通常将这些病例称为难治性根尖周炎。E.faecalis是顽固性或继发性根管内感染的主要致病菌,而生物膜是其适应环境后,定植生存的主要方式;更为重要的是,E.faecalis能通过生物膜抵抗机体的免疫作用,发挥其致病性。研究发现,生物膜形式的E.faecalis其耐药性比浮游E.faecalis高达1000倍。不仅如此,E.faecalis可在饥饿、高碱、低氧等特殊“恶劣”环境中长期生存,粘附在牙本质表面形成生物膜,造成根管再感染。因此,E.faecalis是导致难治性根尖周炎的最主要病因之一,其在难治性根尖周炎感染根管中检出率高达77%,而在未治疗的感染根管中,其检出率仅为7.5%。本课题组长期从事难治性根尖周炎的研究,发现临床分离的E.faecalis其生物膜形成能力不尽相同,那么调节E.faecalis生物膜形成的关键分子是什么?其分子机制又是什么?其是如何调节生物膜的形成的?一直是牙体牙髓病领域研究的热点和难点。随着高通量测序技术广泛应用于微生物基因组的研究,其在口腔微生物宏基因组和基因组功能的研究也相继开展。本课题通过对临床分离的高生物膜形成的E.faecalis进行高通量测序,分析基因表达谱测序结果发现,氮代谢通路的表达与对照组相比有显著性差异,其中编码谷氨酸合成酶的gltA基因表达显著上调,提示gltA基因及谷氨酸代谢途径可能在E.faecalis生物膜形成中发挥重要的调控作用。因此我们将该基因作为目标开展研究,以期为阐明E.faecalis生物膜调控的新机制,提高我们对细菌生物膜调控的认识,更为研发新型抗生物膜药物和抑制剂提供可能的靶位和靶通路。实验分为以下四个部分:第一部分:临床难治性根尖周炎高生物膜形成的E.faecalis的采集、分离与鉴定选取就诊于我科室的难治性根尖周炎病例45例。在严格的无菌操作下进行临床取样,样本在实验室中采用肠球菌培养基和胆汁七叶苷培养基进行体外培养,通过观察颜色变化进行E.faecalis初步鉴定;然后,利用BBL CRYSTAL生化反应系统对初步认定为E.faecalis的分离菌株进行再次鉴定;最后,利用PCR技术和DNA纯化技术,对分离菌株进行16Sr RNA测序,并与基因库中的标准E.faecalis进行基因比对。将确定为E.faecalis的菌株利用结晶紫染色技术检测其生物膜形成能力。结果显示,在收集分离的45例临床病例样本中,有14例鉴定出E.faecalis,检出率为31.1%。生物膜形成能力检测发现:“–”为2株,“+”为3株,“++”为5株,“+++”为4株,高生物膜形成能力的菌株比率为28.6%。第二部分:临床分离的高生物膜形成能力的E.faecalis差异基因的高通量测序分析对4株(S4、S6、S8和S13)临床分离的高生物膜形成能力的E.faecalis进行预处理,提取其DNA基因组并利用Illumina HiSeq2500平台构建DNA文库,提取4株细菌转录组RNA并利用Illumina HiSeq2500平台进行测序。首先,对测序得到的原始最小片段的双端序列reads进行过滤和质量评估,其次,将高质量的reads与参考序列进行比较,最后,根据比较的结果,进行样本的标准分析,如均一性分布分析、饱和度分析等,以及高级分析,如基因结构分析、表达量分析等,重点关注差异基因的表达功能注释。结果发现与对照组标准菌E.faecalisV583相比,4株高生物膜形成能力的E.faecalis共同有152个基因表达发生了下调,有10个基因表达发生了上调,其中氮代谢通路的表达与对照组相比有显著性差异,这其中编码谷氨酸合酶(GOGAT)的gltA基因表达显著上调。gltA基因是谷氨酸代谢途径中的重要分子,提示其及谷氨酸代谢途径在E.faecalis生物膜形成中可能发挥重要的调控作用。第三部分:谷氨酸合酶基因gltA与E.faecalis生物膜形成的相互关系利用激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察临床分离的4株高生物膜E.faecalis24h后生物膜形成能力,通过软件分析生物膜中活菌数量与生物膜体积;然后,采用RT-qPCR技术检测24h内gltA基因的表达水平;最后,利用非标记蛋白质谱定量技术(Label-free Quantitative Proteomic Analysis)检测谷氨酸合酶(GOGAT)24h内的相对表达量。CLSM观察临床分离的4株E.faecalis均能形成结构致密的生物膜,且24h时后生物膜活菌数量和生物膜体积显著高于对照组E.faecalisV583(P<0.05)。RT-qPCR显示,在全部菌株中,gltA基因的表达随着时间的延长而降低,同时4株高生物膜形成能力的E.faecalis中gltA基因在6h和12h的表达量显著高于对照组(P<0.05),在24h无统计学差异(P>0.05);非标记蛋白质谱定量结果显示,GOGAT的含量在6h时显著高于对照组(P<0.05),而12h时两者无统计学差异(P>0.05),24h时则未检测到蛋白含量。以上结果均证明,gltA基因的高表达能增强E.faecalis的生物膜的形成能力,同时还说明,gltA基因编码GOGAT能在生物膜形成的早期阶段(0~6h)通过调节新陈代谢所必需的大分子谷氨酸,对生物膜的生物量产生影响。当生物膜初步形成后(6~12h),gltA基因的表达会受到体内负反馈调控发生降低,从而抑制了GOGAT的合成。第四部分:上、下调谷氨酸合酶基因gltA对E.faecalis生物膜形成能力的影响利用同源重组技术将含有氨苄抗性基因的质粒pHS-AVC电转入到标准菌E.faecalisV583中替换gltA基因,成功构建gltA缺陷E.faecalis菌株。将gltA基因克隆到含有强启动子p32的质粒pmg36e中,电转入标准菌E.faecalisV583,成功构建gltA基因高表达E.faecalis菌株。首先,检测两突变株与对照组E.faecalisV583的生长曲线和生物膜形成能力;然后,利用CLSM观察24h后两突变株与对照组生物膜形成能力,并分析生物膜中活菌数量与生物膜体积;最后,利用RT-qPCR技术检测E.faecalis生物膜形成中其他相关基因的表达量。结果显示,gltA基因高表达株生长速率在进入对数期后高于对照组,相反,gltA基因缺陷株生长速率在对数期后低于对照组,但两者与对照组之间均无统计学差异(P>0.05);生物膜形成能力的结果发现,6h时两突变株生物膜形成能力与对照组相比无统计学差异(P>0.05),但在12h和24h时,gltA基因高表达菌生物膜形成能力明显高于对照组,gltA基因缺陷组则明显低于对照组,且结果均有统计学差异(P<0.05);CLSM结果显示gltA基因高表达株生物膜形成较快,结构致密,厚度增加明显,而gltA基因缺陷菌株生物膜形成较慢,结构松散,厚度下降明显;不仅如此,与对照组相比,gltA基因高表达株在12h和24h活菌数和生物膜体积有显著增高(P<0.05),而gltA基因缺陷菌株在12h和24h活菌数和生物膜体积有显著降低(P<0.05)。生物膜形成中其他相关基因gelE、fsrB、esp、ace、salB和bopD的表达量在gltA基因高表达菌中均显著增高(P<0.05),而在gltA基因缺陷菌中则显著降低(P<0.05)。以上结果说明,基因gltA编码GOGAT合成的谷氨酸盐,是E.faecalis体内众多大分子结构的骨架分子,如肽聚糖。肽聚糖同样是菌体细胞壁的重要组成成分。因此我们认为gltA基因很可能是通过影响E.faecalis细胞壁中的肽聚糖的合成影响了细菌表面结构发生变化,从而改变了其生物膜的形成能力。综上所述,谷氨酸合酶基因gltA能影响E.faecalis生物膜的形成,是调控生物膜的关键分子。