【摘 要】
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目的:非编码RNA在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）分子靶向治疗的耐药中起着重要的调控作用,本研究拟探究长链非编码RNA GAS5（Growth arrest-specific transcript 5）参与非小细胞肺癌酪氨酸抑制剂（Epidermal-growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors
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目的:非编码RNA在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）分子靶向治疗的耐药中起着重要的调控作用,本研究拟探究长链非编码RNA GAS5（Growth arrest-specific transcript 5）参与非小细胞肺癌酪氨酸抑制剂（Epidermal-growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）耐药的可能机制。方法:通过慢病毒转染H1975细胞和奥希替尼耐药H1975OR细胞;CCK-8实验检测亲本细胞组（H1975、H1975+Control、H1975+GAS5）及耐药细胞组（H1975OR、H1975OR-sh Control、H1975OR-sh GAS5）对奥希替尼的耐药指数并计算IC50;q RT-PCR检测两组细胞中LncRNA GAS5、PARP、Caspase-3及PI3K/AKT信号通路及凋亡相关蛋白m RNA表达水平;流式细胞学检测两组细胞中细胞凋亡及细胞周期的变化情况;Western Blot实验分析LncRNA GAS5对EMT相关蛋白的相对表达量的影响。结果:1.CCK-8实验显示奥希替尼在作用24、48小时后对亲本细胞和耐药细胞均有抑制增殖作用,且两组细胞的IC50都随着剂量的增加及时间延长而降低。2.q RT-PCR结果表明:耐药细胞LncRNA GAS5的相对表达量高于亲本细胞。3.流式细胞学实验结果显示:（1）在亲本细胞中过表达LncRNA GAS5后细胞的凋亡率降低;在耐药细胞中敲除LncRNA GAS5后细胞的凋亡率增加,在加入奥希替尼处理后得到相同的结果,且凋亡率均大于对应的未加药组,证明过表达LncRNA GAS5不仅能抑制H1975细胞的凋亡率,而且还能抵抗奥希替尼促进H1975细胞凋亡的作用。（2）细胞周期结果显示:在亲本细胞中过表达LncRNA GAS5后,G0/G1期细胞比例减少,S期细胞及G2/M期细胞比例增加,加入奥希替尼后G0/G1期细胞比例增加,S期细胞及G2/M期细胞比例减少。在耐药细胞中敲除LncRNA GAS5后,G0/G1期细胞比例增加,S期和G2/M期细胞比例降低,加入奥希替尼后G0/G1期细胞比例增加更明显,S期细胞比例降低更明显,G2/M期细胞比例差异不具有统计学意义。证明过表达LncRNA GAS5后亲本细胞增殖活性增强,而敲除LncRNA GAS5能有效的降低耐药细胞的增殖活性,将细胞周期阻滞在G0/G1期。4.Western Blot实验结果显示:耐药细胞中N-cadherin及ZEB-1蛋白的表达量高于亲本细胞,E-cadherin蛋白的表达量低于亲本细胞,在亲本细胞中过表达LncRNA GAS5后,N-cadherin及ZEB-1蛋白的表达量增加,E-cadherin蛋白的表达量降低。在耐药细胞中敲除LncRNA GAS5后,N-cadherin及ZEB-1蛋白的表达量降低,Ecadherin蛋白的表达量增加。这表明过表达LncRNA GAS5后能引起H1975细胞发生EMT的转化,而敲除LncRNA GAS5后能逆转这一现象。5.双荧光素酶报告实验结果证实LncRNA GAS5与mi R-196a具有结合位点。通过q RT-PCR发现在亲本细胞中过表达LncRNA GAS5使mi R-196a降低,进一步验证了GAS5能直接调控mi R-196a并抑制其表达。结论:过表达LncRNA GAS5可以抑制人肺腺癌H1975细胞的凋亡能力,增强H1975细胞的增殖及上皮表型向间质表型转化能力,同时增强H1975细胞对奥希替尼的耐药性;而在H1975OR细胞中敲除LncRNA GAS5则得到相反的结果,表明LncRNA GAS5可以促进EMT的转化参与奥希替尼的耐药。
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