吡嗪（Pyrazines）是一类在1,4位含N原子的六元杂环化合物,通常具有重要的风味价值。其中,化合物2-乙基-3,5/3,6-二甲基吡嗪（2-ethyl-3,5/3,6-dimethylpyrazine,EDMPs）为同分异构体,具有典型的巧克力、焙烤、坚果香气且风味阈值极低,且EDMPs已被证明食用安全,是作为食物香精被广泛应用的前5种吡嗪化合物之一。但是,目前食品工业所需的EDMPs主要依靠化学法生产,随着消费者对天然香料的青睐,微生物法生产EDMPs化合物正在受到关注。然而,可发酵生产EDMPs的安全微生物种属未知,EDMPs的微生物合成途径未知,为EDMPs的微生物高效合成带来极大挑战。传统酿造食品可被认为是一类利用群落微生物降解多样性底物以实现高浓度高复杂性风味化合物的食品。吡嗪本身是包括固态酿造白酒及发酵酱等在内的传统酿造食品中的一类重要风味化合物,暗示传统酿造食品发酵过程可能存在微生物或微生物群代谢底物生产高值吡嗪化合物。本研究的主要研究内容包括:（1）产EDMPs微生物的筛选:鉴于吡嗪类化合物在样品中的浓度通常较低(ng-μg·L^-1),本研究首先优化了GC-MS的检测方法和参数,对242种传统酿造样品中的挥发性化合物进行了检测。最终从酱香型曲料（A1）样品中检测到较高含量的EDMPs,并以该阳性样品为筛选源从中分离得到一株产EDMPs的菌株,通过生理生化实验和分子生物学鉴定,该EDMPs产生菌株为枯草芽孢杆菌属,将其命名为Bacillus subtilis Nr.5。（2）EDMPs合成途径的解析:从EDMPs的结构特点出发,基于已有的烷基吡嗪合成途径相关报道,本研究提出_D-葡萄糖和_L-苏氨酸可能为EDMPs微生物合成的底物,经代谢产生关键前体物质氨基丙酮和2,3-戊二酮参与到EDMPs的合成。因此,本研究首先采用底物添加实验,证明了_D-葡萄糖和_L-苏氨酸可明显的提升EDMPs合成。随后,结合多组合同位素示踪法,添加不同组合方式的_D-[¹³C₆]-葡萄糖和_L-[¹³C₄,¹⁵N]-苏氨酸作为底物,对合成的EDMPs,氨基丙酮和2,3-戊二酮进行质谱分析。结果表明,_D-葡萄糖和_L-苏氨酸是EDMPs合成的底物,其中氨基丙酮（来源于_L-苏氨酸）及2,3-戊二酮（来源于_D-葡萄糖和_L-苏氨酸）是EDMPs合成的中间代谢产物。（3）酱油模拟发酵体系:EDMPs是酿造酱油中的重要风味化合物,探究酱油酿造过程中EDMPs的合成途径有助于实现以风味为导向的精准发酵。因此,本研究首先构建了酱油酿造模拟体系,通过添加不同浓度的推测底物_L-苏氨酸和_D-葡萄糖,且对接种/不接种合成EDMPs的菌株B.subtilis Nr.5的酱油样品进行EDMPs含量的分析。结果表明,B.subtilis Nr.5的接入能有效促进酱油发酵过程中EDMPs的积累,且目标产物EDMPs的浓度随底物浓度的增加而增加。因此,我们推测本研究中EDMPs合成途径是酱油传统发酵过程中EDMPs的合成途径之一。