第一部分小胶质细胞和非小细胞肺癌细胞在脑转移定植中相互作用的研究目的:脑转移作为非小细胞肺癌患者死亡的主要原因之一,关于其内在的分子机制仍不清楚,目前缺乏有效的干预手段。鉴于肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤中的作用日益显著,靶向巨噬细胞的治疗手段受到广泛关注。小胶质细胞作为大脑固有巨噬细胞,在非小细胞肺癌脑转移中的作用和分子机制尚未被揭示。本部分旨在研究脑转移微环境中小胶质细胞和肺癌细胞之间的相互作用和影响。方法:对来自人和裸鼠的非小细胞肺癌脑转移灶的病理切片进行免疫组化染色,用IBA1分子分析活化的小胶质细胞。体外采用Transwell实验选取高侵袭性肺癌细胞系作为研究对象,然后用肺癌细胞的上清作用于小胶质细胞,通过western blot、q RT-PCR和免疫荧光实验检测小胶质细胞M1（i NOS和CD86）和M2（Arg1和CD206）型分子的表达差异,接着用特定活化型小胶质细胞的上清作用于间充质状态的肺癌细胞,在转录和蛋白水平分析上皮表型分子E-钙粘蛋白（E-cadherin）和间充质表型分子波形蛋白（Vimentin）的差异。结果:本研究在人和小鼠的非小细胞肺癌脑转移的标本中均观察到大量活化型小胶质细胞,通过检测小胶质细胞表型分子,发现M2型小胶质细胞活化明显。体外实验显示A549细胞具有较强的侵袭和迁移能力,被选为进一步的研究对象。q RT-PCR、western blot和免疫荧光的结果表明,小胶质细胞用A549细胞上清刺激一定时间后,其M2型标志分子（Arg1和CD206）在转录和蛋白表达水平均明显上调。对于TGF-β1诱导的间充质状态的肺癌细胞（A549和H292）,M2型小胶质细胞的上清可以逆转A549和H292细胞间充质的状态,导致上皮性分子E-钙粘蛋白上调,间充质分子波形蛋白的下调,进而诱导间充质上皮转化的发生。结论:在非小细胞肺癌脑转移灶中小胶质细胞和肿瘤细胞存在相互作用,而这一过程对于上皮间充质转化的肿瘤细胞在转移灶的定植至关重要。第二部分脑转移的非小细胞肺癌细胞诱导M2型小胶质细胞形成的机制研究目的:肿瘤微环境与肿瘤细胞的相互作用对于转移进展是必不可少的,但是至今仍缺少详尽的的机制研究。考虑到M2型肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤进展中的促进作用,本部分希望从分子水平探索脑转移的非小细胞肺癌细胞是如何影响小胶质细胞表型的,进而通过分子干预来控制小胶质细胞的表型转化。方法:以A549细胞为亲本通过体内循环构建高倾向性脑转移细胞,并分别用western blot和Transwell实验分析其上皮/间充质状态以及侵袭转移的能力。采用单细胞测序技术分析脑转移灶中小胶质细胞的亚群分布和相关的信号通路。通过转录组芯片分析高倾向性脑转移细胞和共培养体系中肿瘤细胞各个基因在转录水平的差异,进而找到相互作用的关键基因,接着利用GO和KEGG通路富集寻找在M2型小胶质细胞形成中的信号通路,然后使用小分子抑制剂进行干预,通过western blot检测通路基因的活化状态。最后用双荧光素酶报告基因预测转录水平的调控机制。结果:本研究成功建立了高倾向性脑转移的A549-F3细胞,其上皮性分子表达（Ecadherin）明显下降,同时侵袭转移能力增强,而在体内的脑转移率明显提高。单细胞测序结果显示,脑转移灶中的小胶质细胞处于动态平衡状态,主要为M2型小胶质细胞。结合转录组芯片结果,得出在A549-F3细胞诱导M2型小胶质细胞形成的关键基因为IL6,进一步的通路分析显示,A549-F3细胞分泌的IL-6通过激活小胶质细胞内的JAK2/STAT3信号,导致下游STAT3的磷酸化水平升高,p-STAT3可以直接在转录水平调控Arg1基因的表达,最终影响了小胶质细胞的表型,而使用抑制剂（托珠单抗或者菲卓替尼）干预IL6/JAK2/STAT3通路可以抑制M2型小胶质细胞的形成。结论:非小细胞肺癌脑转移灶中M2型小胶质细胞为优势亚群。高倾向性脑转移的A549-F3细胞可能通过分泌IL6激活JAK2/STAT3通路诱导了M2型小胶质细胞的形成。第三部分通过干预IL6/JAK2/STAT3通路影响非小细胞肺癌脑转移的体内研究目的:现阶段关于脑转移的治疗效果仍然不尽人意,临床也缺乏有效的预测方法。在前面的研究中证实了非小细胞肺癌脑转移中M2型小胶质细胞的重要作用以及可能被IL6/JAK2/STAT3通路诱导,因此有必要针对分子靶点进行临床转化研究,寻找新的治疗靶点。在本部分,希望通过体内研究探索针对通路的分子干预是否可以达到抑制脑转移发生的效果,同时利用临床样本检测非小细胞肺癌患者血浆中IL6的水平,并分析IL6与非小细胞肺癌患者预后的相关性。方法:通过慢病毒转染直接敲低A549-F3细胞内IL6的表达,并分别使用IL6/JAK2/STAT3的通路抑制剂（托珠单抗或者菲卓替尼）进行体内研究,通过活体成像技术在裸鼠肺癌脑转移模型中观察脑转移发生率的变化。收集非小细胞肺癌患者以及裸鼠的外周血标本,利用ELISA试剂盒检测血浆中IL6的含量,以有无脑转移进行分组,比较两组血浆中IL6水平的差异。此外,使用TCGA数据库分析非小细胞肺癌患者以及相应IL6的转录组和生存相关的数据。结果:裸鼠脑转移模型结果表明,直接敲低IL6的表达水平或者使用IL6/JAK2/STAT3通路的抑制剂（托珠单抗和菲卓替尼）都可以降低A549-F3细胞脑转移的发生,也可以明显缩小转移灶的大小（P<0.05）。在动物模型中,伴随脑转移的小鼠血浆中IL-6水平升高（P=0.0009）。在非小细胞肺癌患者中,脑转移组血浆中IL6的含量较无脑转移组升高达2.6倍（P=0.0295）。TCGA数据库分析显示,IL6低表达的非小细胞肺癌患者有更长的生存时间（P=0.0025）。结论:干预IL6/JAK2/STAT3通路可以改变小胶质细胞的表型,同时能降低IL6高表达的肺癌细胞脑转移的发生率。非小细胞肺癌患者血浆中IL6的水平对于脑转移的发生以及患者的生存预后有一定的预测作用。