【摘 要】
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目的:构建一种含有MYC标签的MYH9基因表达载体,对一个MYH9相关疾病家系进行体外实验,探讨凝溶胶蛋白调节细胞微丝骨架和抗凋亡作用在MYH9相关疾病血小板减少中的作用机制。方法:1.在MYH9基因的N-端启动子ATG之后插入MYC标签,构建野生型和突变型MYC-MYH9-pcDNA3.1（-）融合表达载体,转染Hela细胞;2.应用MYC标签多克隆抗体,免疫荧光染色验证融合表达载体在Hela细
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目的:构建一种含有MYC标签的MYH9基因表达载体,对一个MYH9相关疾病家系进行体外实验,探讨凝溶胶蛋白调节细胞微丝骨架和抗凋亡作用在MYH9相关疾病血小板减少中的作用机制。方法:1.在MYH9基因的N-端启动子ATG之后插入MYC标签,构建野生型和突变型MYC-MYH9-pcDNA3.1（-）融合表达载体,转染Hela细胞;2.应用MYC标签多克隆抗体,免疫荧光染色验证融合表达载体在Hela细胞中表达,并观察转染后的细胞内由MYH9基因编码的非肌性肌球蛋白重链ⅡA（Non-muscle myosin heavy chainⅡA,NMMHC-ⅡA）的聚集分布情况;3.免疫荧光染色及Western印迹法检测转染后的细胞内凝溶胶蛋白定位及表达;4.应用罗丹明标记的TRITC-phalldidin,免疫荧光染色观察转染后的细胞微丝骨架形态变化;5.流式细胞术检测转染后的细胞凋亡率。结果:1.本研究成功构建了含有MYC标签的野生型和突变型MYC-MYH9-pc DNA3.1（-）融合表达载体。2.免疫荧光染色显示转染后的野生组和突变组Hela细胞MYC标签蛋白免疫反应性为阳性,空转组为阴性,表明野生型和突变型MYH9融合表达载体在Hela细胞中成功表达。野生组Hela细胞胞浆内NMMHC-ⅡA呈弥散均匀分布;而突变组Hela细胞胞浆内可见NMMHC-ⅡA聚集呈杆状。3.免疫荧光染色显示转染后的野生组Hela细胞中凝溶胶蛋白呈均匀弥漫分布;而突变组Hela细胞中凝溶胶蛋白发生异常聚集呈点状散在分布,部分凝溶胶蛋白定位于肌动蛋白应力纤维束上呈细丝状排列,分布于细胞边缘。Western印迹法检测转染后的细胞凝溶胶蛋白表达,结果显示突变组Hela细胞凝溶胶蛋白/GAPDH表达（0.5±0.04）显著高于野生组（0.3±0.04）（P<0.01）。4.免疫荧光染色显示转染后的野生组Hela细胞中聚合的肌动蛋白（F-Actin）应力纤维呈同方向细丝状均匀排列;而突变组Hela细胞F-Actin有断裂现象,形成中央空洞状态,表明F-Actin应力纤维减少,细胞微丝骨架排列失调。5.流式细胞术检测转染后的细胞凋亡率,结果显示野生组Hela细胞凋亡率（24.2%±0.9%）显著高于突变组（5.5%±0.3%）（P<0.0001）。结论:本研究体外细胞实验证实MYH9 exon41 c.5818＿5819ins AATGGCCCGGAAAGGCGCCG移码突变是本例MYH9-RD发病的分子基础。凝溶胶蛋白介导的细胞微丝骨架重排异常和抗凋亡作用可能是MYH9-RD血小板减少的重要发病机制。本研究为进一步探究MYH9-RD发病机制提供了新的研究方向和靶向治疗的理论基础。
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