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本文研究比较了癸甲溴铵和甲醛两种消毒剂对褐牙鲆的毒性、药效方面的差异,并研究了癸甲溴铵对褐牙鲆非特异性免疫、组织酶活力的影响,还初步探讨了癸甲溴铵产生细胞毒性的机制,旨在为癸甲溴铵在水产养殖中推广及合理使用提供理论依据。
1.癸甲溴铵和甲醛对褐牙鲆的急性毒性
通过药浴方式,进行了癸甲溴铵和甲醛对褐牙鲆的急性毒性试验,并对癸甲溴铵引起的中毒死亡褐牙鲆进行了病理组织学观察。结果表明,在19.0~21.0℃和24.5~25.5℃,癸甲溴铵对褐牙鲆的24h、48h半数致死浓度(LC<,50>)和安全浓度(Sc)分别为6.35mg/L、4.84mg/L、0.84mg/L和2.43mg/L、2.14mg/L、0.50mg/L;在24.5~25.5℃,甲醛对褐牙鲆的24h、48h半数致死浓度(LC<,50>)和安全浓度(Sc)分别为413.6mg/L、315.7mg/L、55.2mg/L。通过对中毒死亡褐牙鲆的病理组织学观察表明,癸甲溴铵对褐牙鲆的鳃损害最严重,对肝脏、肾脏的损伤相对较轻,特别是对鳃的损伤与鱼的死亡有很大的关系。
2.癸甲溴铵和甲醛的药效学研究
采用二倍稀释法,进行了癸甲溴铵和甲醛对鳗弧菌、副溶血弧菌的体外抑菌试验;用鳗弧菌L-18株人工感染褐牙鲆,做了癸甲溴铵和甲醛对褐牙鲆细菌性疾病的防治效果实验。结果表明,癸甲溴铵对两种致病菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为0.25mg/L、0.50mg/L;甲醛对两种致病菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为40mg/L、80mg/L;防治效果试验表明,0.3mg/L癸甲溴铵和50mg/L甲醛药浴均可有效防治鳗弧菌引起的褐牙鲆细菌性疾病。以上研究得出,褐牙鲆对甲醛的耐受力很强,但海水鱼致病菌对甲醛的耐受力也很强,50mg/L甲醛能对褐牙鲆细菌性疾病起到防治效果,而癸甲溴铵只需0.3mg/L(低于安全浓度)就能达到相同防病效果,充分体现了癸甲溴铵杀菌浓度低、用量少的特点。
3.癸甲溴铵对褐牙鲆非特异性免疫的影响及病理组织观察
采用药浴的方式,研究了癸甲溴铵暴露对褐牙鲆血清溶菌酶和补体旁路激活活力(ACH<,50>)的影响,来探讨亚致死量的癸甲溴铵对褐牙鲆非特异性免疫的影响。结果表明,低剂量(0.5mg/L)癸甲溴铵处理,对溶菌酶活力和ACH<,50>无显著影响;中剂量(1.0mg/L)处理,在实验开始能激活溶菌酶和ACH<,50>,随着作用时间的延长,逐渐呈抑制作用;高剂量组(2.0mg/L),在短时间(1d)能引起溶菌酶活力和.ACH<,50>提高幅度较大,但很快就开始起抑制作用。由此得出,安全剂量(0.5mg/L)癸甲溴铵对褐牙鲆非特异性免疫不产生明显影响,随着癸甲溴铵浓度的增大和作用时间的延长,会引起褐牙鲆血清中溶菌酶和ACH<,50>活力下降,对褐牙鲆非特异性免疫造成损伤。
4.癸甲溴铵对褐牙鲆组织酶活性的影响
采用药浴的方式,研究了癸甲溴铵暴露对褐牙鲆鳃、肝、肾组织中Na<+>-K<+>-ATPase和SOD活性的影响,旨在探讨亚致死量的癸甲溴铵对褐牙鲆各组织造成的潜在危害,找出癸甲溴铵攻击的靶组织及反映褐牙鲆受毒害程度的标志酶。结果表明,低剂量(0.5mg/L)癸甲溴铵处理,短时间(1d)内对鳃组织Na<+>-K<+>-ATPase活性有显著性降低作用,但对肝和肾组织中酶活性无明显影响;高剂量(1.0mg/L、2.0mg/L)癸甲溴铵暴露对鳃、肝、肾组织Na<+>-K<+>-ATPase活性均有显著性抑制作用。低剂量(0.5mg/L)癸甲溴铵处理,短时间(1d)内对鳃组织SOD活性有明显增强作用,但对肝和肾组织SOD活性无明显影响;1.0mg/L癸甲溴铵暴露,在试验前期能激活各组织中的SOD活性,随着处理时间的延长逐渐呈抑制作用;2.0mg/L癸甲溴铵暴露,各组织中SOD活性一直呈下降趋势。由此可以得出,鳃组织中的酶活性对癸甲溴铵较敏感,可以认为鳃是癸甲溴铵攻击的主要靶组织;鳃组织中Na<+>-K<+>-ATPase对癸甲溴铵最为敏感,可以将其作为反映癸甲溴铵对褐牙鲆损伤程度的标志酶。5.癸甲溴铵对褐牙鲆头肾巨噬细胞胞内[Ca<2+>];与呼吸爆发的影响从褐牙鲆头肾中分离巨噬细胞,培养在有钙介质的L-15培养基中,体外暴露癸甲溴铵后,分别研究了癸甲溴铵对巨噬细胞胞内[Ca<2+>]<,i>、呼吸爆发和细胞成活率的影响,并用Thapsigargin(Thaps)研究了癸甲溴铵的升钙机制。结果表明,癸甲溴铵刺激能提高巨噬细胞胞内钙水平,在癸甲溴铵加入的第2分钟到达峰值,用Thaps来预处理细胞后,癸甲溴铵引起的胞内[Ca<2+>]<,i>的提高会得到明显抑制;癸甲溴铵刺激能提高巨嗜细胞呼吸爆发强度,在癸甲溴铵加入的第3分钟达到峰值;细胞成活率试验结果表明,在癸甲溴铵(0.6和1.0mg/L)刺激的第2分钟和第3分钟,有明显的细胞死亡现象。得出结论:癸甲溴铵能通过胞外钙内流和激发细胞内质网钙库来提高胞内[Ca<2+>]<,i>,胞内[Ca<2+>]<,i>的提高能通过一系列信号传导过程使细胞进入呼吸爆发状态,产生大量的活性氧,过量的活性氧和胞内高浓度的Ca<2+>都能产生细胞毒性,导致细胞死亡。