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研究背景:腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm,AAA）是一种表现为腹主动脉局部持久性扩张的慢性炎症性血管病变。一旦发生瘤体破裂,致死率高达80%以上,因而AAA是一种高危性疾病。除了外科手术外,目前缺乏有效的药物治疗方法。AAA的病理机制主要包括内皮屏障功能失调,血管壁大量炎症细胞浸润,中层血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）凋亡,以及弹力纤维断裂、胶原蛋白沉积,细胞外基质重构等。既往研究报道,AAA瘤壁浸润的炎症细胞以巨噬细胞为主,后者通过分泌促炎细胞因子、基质金属蛋白酶及氧自由基等机制促进AAA的发生和发展。趋化因子7（C-C chemokine ligand 7,CCL7）属于趋化因子家族,可通过趋化巨噬细胞、肥大细胞、嗜酸性细胞等多种细胞浸润到局部组织,在多种炎症性疾病中发挥重要作用。CCL7在AAA中是否发挥作用及其可能作用机制,迄今尚未见报道。研究目的:本研究通过建立血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）诱导的AAA模型,利用离体细胞培养实验,分别从整体、组织和细胞水平,探索CCL7在AAA形成中的作用以及可能分子机制。进一步在Ang Ⅱ诱导的AAA模型小鼠中应用腹腔注射CCL7中和抗体的方法,研究CCL7中和抗体在AAA形成中的作用。研究方法:1、选择8-10周龄ApoE基因敲除(ApoE-/-)雄性小鼠,皮下植入ALZET渗透微泵,分别持续性给予Ang Ⅱ（1000ng/kg·min）或生理盐水共28天。植入微泵前1天（基线）及第28天分别利用小动物超声成像系统检查肾上动脉,获取腹主动脉最大管腔内径及最大管腔面积。AAA定义为最大腹主动脉直径较基线水平增加≥50%。实验期间每周测量小鼠体重,血压,每天观察小鼠存活情况。在实验终点处死小鼠,分别留取血浆及新鲜动脉组织,血浆用于检测CCL7水平,腹主动脉用于提取RNA、蛋白。部分小鼠用10%福尔马林通过左心室灌注使主动脉固定于血管舒张状态后分离腹主动脉经石蜡包埋,用于后续组织切片染色检测。2、选择8-10周龄C57 BL/6J雄性小鼠,颈椎脱臼法处死小鼠,无菌条件下分离获取小鼠两侧胫腓骨。用无菌PBS溶液冲洗小鼠骨髓腔,收集并获取骨髓细胞。利用1640RPMI培养基添加10%胎牛血清在体外培养骨髓细胞,以重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子（recombinant murine macrophage colony stimulating factor,M-CSF）诱导7天,获取骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow derived macrophage,BMDM）,进行细胞学鉴定。以小鼠重组CCL7刺激因子（recombinant murine CCL7,rm CCL7）与BMDM共培养24h,观察CCL7对BMDM的增殖、迁移和分化等细胞表型的作用及其对细胞内信号分子的影响。利用q RT-PCR研究CCL7对BMDM细胞膜相应受体的影响。利用CCR1特异性拮抗剂（BX471）、JAK2特异性抑制剂（Fedratinib）及STAT1特异性抑制剂（Fludrabine）分别与BMDM共培养1小时后在培养基中加入rm CCL7,探讨CCL7对BMDM增殖、迁移、分化等细胞表型影响的可能细胞内作用机制。3、选择8-10周龄ApoE-/-雄性小鼠,皮下植入ALZET渗透微泵持续性给予Ang Ⅱ（1000ng/kg·min）。随机分三组,每组10只小鼠,（1）CCL7-n Ab组:CCL7中和抗体（CCL7-neutralizing antibody）腹腔注射20ug/次（200ul）,每3天注射一次;（2）Control Ig G组:对照Ig G抗体（control Ig G antibody）腹腔注射20ug/次（200ul）,每3天注射一次;（3）PBS组:PBS腹腔注射200ul/次,每3天注射一次。实验时间为28天,分别在植入微泵前1天（基线）及第28天利用小动物超声成像系统检查肾上动脉,获取腹主动脉最大内径及最大面积。实验期间每周测量小鼠体重,血压,每天观察小鼠存活情况。在实验终点处死小鼠,用10%福尔马林通过左心室灌注使主动脉固定于血管舒张状态,体视显微镜下分离腹主动脉,10%福尔马林浸泡后的腹主动脉分离剔除周围脂肪组织,利用Image Pro软件在体视显微镜下测量腹主动脉最大外径。固定的腹主动脉组织石蜡包埋,用于后续组织切片染色检测。4、采用ELISA方法分别检测各组小鼠血浆CCL7丰度,应用免疫组织化学染色半定量分析腹主动脉瘤壁组织CD68阳性细胞数量,应用免疫荧光染色技术对腹主动脉瘤壁组织进行CCL7、α-SMA和Vimentin染色,应用Verhoeff Van Gieson/EVG染色定性分析弹力纤维,应用改良Masson三色染色法定性分析胶原沉积情况。5、统计学分析:所有计量数据均以均数±标准误描述,用Sigma Plot 12.5进行统计学分析和作图。根据数据类型及组别不同,分别采用Student t检验或One-way ANOVA分析比较。生存曲线采用Log-Rank Test评价分析。P＜0.05认为差异存在统计学意义。研究结果:1、实验终点,Ang Ⅱ组14只小鼠发生腹主动脉瘤（14/17,82.4%）,其中2只小鼠因腹主动脉瘤破裂死亡（11.8%,2/17）或1只小鼠发生胸、腹主动脉瘤同时破裂死亡（5.9%,1/17）;生理盐水组小鼠均存活。Ang Ⅱ组小鼠腹主动脉最大内径及面积均较生理盐水组显著性增加（P＜0.01）。与生理盐水组相比,Ang Ⅱ组主动脉组织内CCL7的m RNA及蛋白水平表达量均显著性增加（P＜0.01）,血浆CCL7浓度也显著性升高（P＜0.01）,CCL7相应受体CCRs表达中,以CCR1受体表达量具有统计学差异（P＜0.05）。应用组织免疫荧光共染技术发现,CCL7主要分布于腹主动脉壁组织中层VSMC和外膜成纤维细胞,免疫组化观察到腹动脉瘤壁中有大量巨噬细胞浸润,主要分布在中层和外膜层。2、细胞transwell实验发现rm CCL7能促进BMDM迁移,q RT-PCR发现rm CCL7可促进BMDM表达ICAM及VCAM等黏附分子,上述作用可被CCR1拮抗剂（BX471）所抑制。rm CCL7能诱导BMDM表达i NOS、IL-6、IL-12A、IL12B、TNF-α等M1型标志物m RNA水平显著性增高（P＜0.001）,CD206、Arg1等M2型标志物m RNA水平无显著性改变。Western-blot检测发现,rm CCL7能诱导BMDM细胞内JAK2/STAT1蛋白水平上调（P＜0.05）。在Ang Ⅱ诱导的AAA组织中,i NOS、JAK2和STAT1蛋白表达量也显著性增高（P＜0.05）。CCR1拮抗剂（BX471）、JAK2抑制剂（Fedratinib）或STAT1抑制剂（Fludarabine）预处理BMDM均可抑制rm CCL7诱导的M1型标志物水平的上调。此外,BX471预处理BMDM可显著性抑制rm CCL7诱导的JAK2/STAT1蛋白表达量增加（P＜0.05）。3、实验终点,PBS组、Control Ig G组及CCL7-n Ab组小鼠的体重、血压、生存曲线及死亡率均无统计学差异。CCL7-n Ab组小鼠AAA发生率（3/10,30%）显著低于PBS组（8/10,80%）和Control Ig G组小鼠（8/10,80%,P＜0.05）。与PBS组和Control Ig G组小鼠相比,CCL7-n Ab小鼠腹主动脉的最大管腔内径（P＜0.01）、最大管腔面积（P＜0.01）,以及最大管腔外径的增加程度均显著性减轻（P＜0.05）。病理组织和免疫组化检查发现,CCL7-n Ab组小鼠瘤壁组织的巨噬细胞浸润显著减轻,弹力纤维断裂及胶原沉积明显改善。结论:本研究发现CCL7能促进Ang Ⅱ诱导的腹主动脉瘤形成,可能通过CCR1/JAK2/STAT1通路介导巨噬细胞向主动脉壁浸润并向促炎表型分化而发挥作用。CCL7中和抗体能显著降低AAA的发生率,可能保护机制是抑制主动脉壁巨噬细胞浸润和延缓血管重构。本研究结果提示CCL7可能成为AAA防治的潜在分子靶点,具有重要的临床转化价值。