论文部分内容阅读
目的:所有慢性肾脏病进展至终末期肾病都伴随着共同的病理生理过程,即肾间质纤维化。目前临床中尚缺乏抗肾间质纤维化有效可行的治疗办法。炎症反应是肾间质纤维化的始动因素。肾间质纤维化的本质是肾小管萎缩和细胞外基质过度堆积。肌成纤维细胞是分泌细胞外基质的主要效应细胞,其数量与肾间质纤维化程度相平行。肌成纤维细胞的来源涉及成纤维细胞活化、上皮-间充质细胞转分化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）和骨髓来源的纤维细胞等多种机制。近年来发现Janus激酶家族（Janus kinase,Jak）/信号转导和转录激活因子（signal transducers and activators of transcription,Stat）信号通路在肾脏疾病中发挥重要作用。同时研究显示阻断Stat3激活可抑制成纤维细胞活化,改善单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction,UUO）肾间质纤维化。Ruxolitinib（芦可替尼）是Jak1和Jak2的选择性抑制剂,目前临床中用于治疗骨髓纤维化。临床研究发现经Ruxolitinib治疗后骨髓纤维化患者血中促炎细胞因子明显减少,且部分患者骨髓纤维化程度改善。本研究采用UUO肾间质纤维化动物模型和体外活化的成纤维细胞,探讨Ruxolitinib对肾间质纤维化的疗效及相关分子机制。本研究旨在为肾间质纤维化的治疗提供新的临床药物,解决临床实际问题。研究方法:1.采用野生型C57BL/6小鼠建立UUO模型,分别设定假手术组（Sham）、模型组（UUO）和Ruxolitinib治疗组（UUO+RUX）。术后2周为肾间质纤维化时间点收取血和肾组织标本。采用酶法检测血清肌酐值。采用糖原染色（periodic acid Schiff,PAS）和Masson三色染色评估肾小管损伤和肾间质纤维化程度。采用免疫组化染色和免疫蛋白印迹（Western blot,WB）检测I、III型胶原（collagen I、III）和纤黏连蛋白（fibronectin,FN）分析细胞外基质沉积,Western blot检测基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（tissue inhibitor of metallopeptidase 1,Timp-1）分析细胞外基质降解。采用免疫组化染色和Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）分析间质肌成纤维细胞活化。采用免疫组化染色和Western blot检测E-钙粘蛋白（epithelial calcium-dependent adhesion,E-cadherin）、以及Western blot检测Snail、Twist分析肾小管上皮细胞EMT。采用免疫组化染色和Western blot检测剪切型半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）以及TUNEL染色检测细胞凋亡。采用黄嘌呤氧化酶法检测总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase,T-SOD）以及采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid,TBA）方法检测丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平分析肾组织氧化应激。采用免疫组化染色检测F4/80以及实时荧光定量PCR（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）检测肾组织单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）mRNA水平分析肾组织巨噬细胞募集和浸润。采用Western blot检测核因子κB-p65（nuclear factorκB-p65,NFκB-p65）和p-NFκB-p65、以及Real-time PCR检测白介素-1β1（interleukin-1β1,IL-1β1）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）mRNA水平分析肾组织炎症反应。采用Western blot检测信号通路相关指标包括Stat3和p-Stat3,细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,Erk）和p-Erk,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）和p-mTOR,Akt和p-Akt,以及Yes相关蛋白（yes-associated protein,Yap）研究分子机制。2.采用重组人TGF-β1诱导的正常肾成纤维细胞NRK-49F活化模型,分别设立空白对照组（CON）,TGF-β1诱导组（TGF-β1）,TGF-β1与Ruxolitinib治疗组（TGF-β1+RUX）。采用Western blot方法检测α-SMA及Collagen I、III和Fibronectin分析成纤维细胞活化和细胞外基质分泌,检测信号通路相关p-Stat3、Stat3、p-Erk、Erk、p-mTOR、mTOR、p-Akt、Akt和Yap研究分子机制。采用MTT检测成纤维细胞增殖能力。3.采用重组人TGF-β1诱导的正常肾小管上皮细胞NRK-52E的EMT模型,分别设立空白对照组（CON）,TGF-β1诱导组（TGF-β1）,TGF-β1与Ruxolitinib治疗组（TGF-β1+RUX）。采用Western blot方法检测E-cadherin、Snail和Twist分析肾小管上皮细胞EMT。结果:1.UUO组小鼠肾组织可见肾小管片状萎缩、肾间质片状纤维化、间质炎细胞浸润以及蛋白管型形成,UUO+RUX治疗组较UUO组肾小管损伤程度和肾间质纤维化面积明显减少。2.Sham组小鼠肾组织几乎不表达CollagenⅠ、Ⅲ和Fibronectin蛋白,UUO组上述蛋白水平明显增加,UUO+RUX治疗组较UUO组上述蛋白水平明显减少。UUO组较Sham组Timp-1蛋白水平增加,而UUO+RUX治疗组Timp-1蛋白水平较UUO组下降。3.Sham组小鼠肾组织仅在动脉血管壁表达α-SMA蛋白,UUO组肾间质可见大量α-SMA蛋白强阳性表达,UUO+RUX治疗组较UUO组α-SMA蛋白阳性面积明显减少。4.TGF-β1组NRK-49F细胞较对照组α-SMA及CollagenⅠ、Ⅲ和Fibronectin蛋白水平明显增加,TGF-β1+RUX治疗组上述蛋白水平较TGF-β1组明显下降。TGF-β1组成纤维细胞增殖能力较对照组升高,而TGF-β1+RUX治疗组较TGF-β1组增殖能力下降。5.UUO组小鼠肾组织较Sham组E-cadherin蛋白水平减少,Snail和Twist蛋白水平升高,而UUO+RUX治疗组较UUO组E-cadherin蛋白水平升高,Snail和Twist蛋白水平减少。6.TGF-β1组NRK-52E细胞较对照组E-cadherin蛋白水平减少,Twist和Snail蛋白水平增多,TGF-β1+RUX治疗组较TGF-β1组E-cadherin蛋白水平增多,Twist和Snail蛋白水平减少。7.UUO组小鼠肾组织巨噬细胞浸润较Sham组明显增多,UUO+RUX治疗组巨噬细胞浸润较UUO组有所减少。UUO组小鼠肾组织MCP-1 mRNA水平显著高于Sham组,UUO+RUX治疗组MCP-1 mRNA水平显著低于UUO组。8.UUO组小鼠肾组织p-p65和p65蛋白水平高于Sham组,UUO+RUX治疗组与UUO组相比p-p65蛋白水平减低。UUO组小鼠肾组织TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA水平较Sham组明显升高,UUO+RUX治疗组上述因子mRNA水平较UUO组明显下降。9.UUO组小鼠肾组织Cleaved-caspase-3阳性细胞数明显多于Sham组,主要集中在肾小管上皮细胞,UUO+RUX治疗组较UUO组Cleaved-caspase-3阳性细胞数减少。UUO组小鼠肾组织Cleaved-caspase-3蛋白水平明显高于Sham组,UUO+RUX治疗组较UUO组Cleaved-caspase-3蛋白水平降低。UUO组小鼠肾组织肾小管上皮细胞TUNEL染色阳性细胞凋亡数较Sham组增加,UUO+RUX治疗组TUNEL染色阳性细胞凋亡数较UUO组减少。10.UUO组小鼠肾组织T-SOD水平低于Sham组,UUO+RUX治疗组T-SOD水平较UUO组增高;UUO组小鼠肾组织MDA水平高于Sham组,UUO+RUX治疗组MDA水平较UUO组下降。11.UUO组小鼠肾组织p-Stat3、Stat3、p-Erk和Erk蛋白水平均明显高于Sham组,UUO+RUX治疗组p-Stat3和p-Erk蛋白水平较UUO组明显下降。TGF-β1组NRK-49F细胞较对照组p-Stat3和p-Erk蛋白水平升高,TGF-β1+RUX治疗组较TGF-β1组p-Stat3和p-Erk蛋白水平下降。12.UUO组小鼠肾组织p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR和Yap蛋白水平均明显高于Sham组,UUO+RUX治疗组p-Akt、p-mTOR和Yap蛋白水平较UUO组明显下降。TGF-β1组NRK-49F细胞较对照组p-Akt、p-mTOR和Yap蛋白水平明显升高,TGF-β1+RUX治疗组p-Akt、p-mTOR和Yap蛋白水平较TGF-β1组下降。结论:1.Ruxolitinib能改善UUO小鼠肾小管损伤和肾间质细胞外基质堆积。2.Ruxolitinib能抑制UUO小鼠和体外培养的成纤维细胞活化,减轻UUO小鼠和体外培养的肾小管上皮细胞EMT。3.Ruxolitinib能减轻UUO小鼠肾组织炎症反应和氧化应激损伤,降低UUO小鼠肾小管上皮细胞凋亡。4.Ruxolitinib能抑制UUO小鼠和活化的成纤维细胞Stat3、Erk和Akt/mTOR/Yap信号通路激活。5.Ruxolitinib治疗可改善UUO小鼠肾间质纤维化,有望成为临床治疗纤维化肾病的一种新的药物。