背景:先天性膈疝（congenital diaphragmatic hernia,CDH）是一种罕见的先天性发育异常,导致腹腔脏器疝入胸腔引起一系列呼吸系统病理生理改变,其在活产儿中的发生率约1/3300。随着产前诊断、宫内干预、新生儿重症监护和手术技术的发展,膈疝患儿的生存率得到明显提高。但是,膈疝相关的肺发育不良和持续性肺动脉高压仍然是重症膈疝患儿预后不良的主要因素。同时,流行病学研究提示,单纯手术修补膈肌缺损,解除腹腔脏器的挤压后,不能有效改善重症膈疝患儿预后。因此,研究CDH相关性肺发育不良的分子机制,为膈疝患儿的诊断和治疗提供新的手段,对有效改善CDH患儿的预后尤为重要。胚胎肺发育是一个复杂的协调过程,需要气道上皮细胞与周围间质环境细胞的分化和相互作用。CDH相关性肺发育不良的特征是有效肺表面积减少,肺实质远端分支减少,肺泡减少。肺泡壁增厚,肺间质成分异常,顺应性下降。严重致死性CDH患儿在肺发育的假腺期出现分支阻滞或延迟的形态学特征。在胚胎肺发育的不同阶段,存在多种进化保守的信号通路,特别是成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白、无翅分泌糖蛋白（WNT）和Hedgehog/Gli信号参与肺的形态发生和上皮分化。此外,这些信号通路与TTF1、GATA6和Foxa2等肺发育关键转录因子之间良好的平衡和相互作用对于正常的肺形态发生至关重要。Foxa转录因子家族在胚胎发育、细胞周期调控、免疫调节等方面具有广泛的功能。Foxa2是气道上皮细胞分化和肺发育的关键转录调控因子,其在肺组织中的表达仅限于肺上皮细胞及其细胞亚群。转录因子及其信号通路在调控早期肺发育过程中已被广泛研究,在肺上皮细胞中,Foxa2调节Shh及其依赖基因来影响肺分支发育所必需基因的表达。构建除草醚诱导的CDH大鼠模型,通过蛋白组学测序分析,发现Foxa2在CDH肺组织中的表达明显下调。然而,Foxa2在CDH肺组织中的时空表达及其在肺发育中的调控机制尚不清楚。目前10%的CDH患者有染色体异常,但85%的CDH患儿的遗传原因仍不清楚,单卵双胞胎（一个胎儿膈疝）的不一致性也强调了考虑表观遗传因素的重要性。MicroRNAs（miRNA）是重要的表观遗传调控因子,对胚胎发育和器官发生至关重要。对人和鼠的肺组织不同发育阶段miRNAs表达分析表明,mi RNAs的功能在一定程度上是进化保守的。Dicer是miRNAs加工过程中的关键组成部分,在肺发育过程中其失活将抑制肺上皮分化。因此,调节Foxa2活性的miRNAs被认为是肺发育的主要分子介质。目的:通过构建除草醚诱导的CDH大鼠模型,以蛋白质组学数据及生物信息学分析为基础,探讨miR-130a-5p/Foxa2轴在除草醚诱导的CDH相关的肺发育不良中的作用机制,并评估其在体内产前治疗中的潜在作用。方法:1、构建除草醚诱导的CDH大鼠模型:将SD孕鼠随机分CDH组（CDH）和对照组（CON）,在妊娠第8.5天（即E8.5）,CDH组孕鼠给予除草醚100mg（溶于1ml橄榄油）灌胃,CON组孕鼠仅给予1ml橄榄油灌胃。分别于E13.5、E15.5、E17.5、E19.5和E21.5天取胎鼠肺组织。选取E17.5天CDH组和CON组胎鼠肺组织进行TMT蛋白质组学测序,对差异表达蛋白进行GO、KEGG等聚类分析。2、通过Real-time PCR、Western blot和免疫组化方法,检测Foxa2在胚胎肺发育过程中的时空表达情况。通过免疫荧光方法,观察Foxa2及肺上皮细胞标志物在CON组与CDH组的表达差异及定位。通过免疫组化和Western blot方法检测细胞增殖及凋亡水平的改变。3、利用生物信息学软件预测与Foxa2 mRNA结合的miRNAs并对结合位点进行鉴定,构建Foxa2野生型及突变型荧光素酶载体,将其与miR-130a-5p的mimics在293T细胞中共同转染,通过荧光素酶实验检测荧光素酶活性。通过Real-time PCR和原位杂交方法检测mi R-130a-5p在胚胎肺发育过程中的时空表达情况。4、利用胚胎肺组织体外培养技术,在培养环境中增加Foxa2或/和miR-130a-5p后,通过计算肺组织终末分支数和培养表面积来评估肺发育情况。同时,EdU和Western blot方法检测培养96h后,肺组织的增殖及凋亡情况。通过Real-time PCR和Western Blot方法,检测体外培养肺组织中下游Shh/Gli1信号通路的改变。5、构建Foxa2过表达及敲低的肺上皮细胞系,利用CCK-8以及EdU实验对Foxa2过表达及敲低的肺上皮细胞的增殖能力进行检测;利用流式细胞仪对Foxa2过表达及敲低的肺上皮细胞的凋亡能力进行检测。构建miR-130a-5p过表达及敲低的肺上皮细胞系,利用CCK-8以及EdU实验对miR-130a-5p过表达及敲低的肺上皮细胞的增殖能力进行检测;利用流式细胞仪对miR-130a-5p过表达及敲低的肺上皮细胞的凋亡能力进行检测。通过Real-time PCR和Western Blot方法,检测肺上皮细胞中过表达miR-130a-5p和Foxa2后,下游Shh/Gli1信号通路的改变。结果:1、胎鼠肺组织TMT蛋白质组学测序:共鉴定79个差异表达蛋白（DEPs）,其中膈疝组上调DEPs有50个,下调DEPs有29个。进行GO富集分析,发现DEPs富集在蛋白激活级联,补体激活,上皮向间质转化的调节等重要生物学过程。进行KEGG富集分析,可观察到富集的通路有细胞凋亡、磷脂酶D信号通路、HIF-1信号通路、补体和凝血级联、Glycerolipid新陈代谢等。其中,Foxa2蛋白在CDH组胎鼠肺组织中的表达下调,通过在线软件STRING分析,发现Foxa2、Shh和Gli1分子间存在相互调控机制。因此,我们选择Foxa2及Shh信号通路作为研究对象,进一步探讨其在先天性膈疝大鼠模型中的表达变化及其对肺发育的影响。2、Foxa2在胚胎肺发育过程中的时空表达:在CDH大鼠模型中,在E15.5天,Foxa2在mRNA水平表达与对照组未见明显差异,而在蛋白水平存在明显表达差异;在E17.5、E19.5和E21.5天,Foxa2在CDH组的表达明显低于对照组。免疫组化结果提示,Foxa2在胚胎肺发育早期（E13.5和E15.5天）表达限于气道上皮细胞（近端支气管上皮细胞）,且在膈疝组表达低于对照组;而胚胎肺发育后期,在小管期（E19.5）和囊泡期（E21.5）,Foxa2在CDH组远端支气管上皮细胞中表达明显降低。同时检测囊泡期（E21.5）肺组织提示,膈疝组肺上皮细胞增殖减弱且凋亡增高。3、miR-130a-5p与Foxa2的互作关系及其在胎鼠肺组织中的表达:使用生物信息学软件预测Foxa2与miR-130a-5p的结合位点,并通过荧光素酶实验进行验证。在先天性膈疝大鼠模型肺组织中,mi R-130a-5p在CDH组肺组织中表达显著上调,且与Foxa2表达呈相反趋势。原位杂交结果提示,在肺发育的小管（E19.5）和囊泡（E21.5）阶段,miR-130a-5p在大气道近端上皮衬里的表达高于远端终末小泡的上皮细胞。4、miR-130a-5p/Foxa2轴对体外培养肺组织分支发育的影响:在胚胎肺组织体外培养环境中,过表达Foxa2后,CDH组肺分支发育得到部分改善,表现为终末分支数增多、培养面积增大、上皮细胞增殖增强和凋亡较弱;而miR-130a-5p表达增加后,能够部分削弱Foxa2所改善的肺发育情况。同时,通过检测Shh和Gli蛋白水平来评估Shh信号通路的激活情况,在CDH组,过表达Foxa2后,Shh和Gli1的表达水平升高;而过表达miR-130a-5p后,Foxa2的表达水平降低,同时Shh信号通路的激活受到部分抑制。5、miR-130a-5p/Foxa2调控Shh/Gli1信号通路对肺上皮细胞增殖分化的影响:在人肺上皮细胞系（BEAS-2B）中,miR-130a-5p的过表达显著抑制Foxa2的表达。CCK-8及EdU实验结果显示过表达Foxa2后细胞增殖能力增强,流式实验显示过表达Foxa2后细胞凋亡率降低。CCK-8及EdU实验结果显示沉默miR-130a-5p后细胞增殖能力增强,流式实验显示沉默mi R-130a-5p后细胞凋亡率降低。恢复实验证实miR-130a-5p通过抑制Foxa2表达来调控肺上皮细胞的增殖和凋亡。结论:1、基于先天性膈疝胎鼠肺组织蛋白质组学结果,在先天性膈疝大鼠模型肺发育过程中,Foxa2在膈疝肺组织中呈低表达,且其表达定位于肺上皮细胞及其亚群。2、miR-130a-5p在膈疝肺组织中呈高表达,与Foxa2在膈疝肺组织中表达呈相反趋势,且Foxa2靶向结合miR-130a-5p。3、miR-130a-5p/Foxa2轴通过调控Shh/Gli1信号通路参与先天性膈疝胎鼠肺分支发育过程。4、miR-130a-5p通过调控Foxa2影响肺上皮细胞的增殖和凋亡。