目的:JC病毒（John Cunningham virus,JCV）是多瘤病毒家族成员之一（家族成员还包括SV40和BK病毒）,其基因组为环状双链DNA。JCV主要通过消化道和呼吸道进入人体,寄生在淋巴组织和泌尿系统中。当人体免疫力低下时,JCV大量复制并损伤神经系统,导致进展性多灶白质脑病（PML）,或整合到人体基因组参与肿瘤发生。JCV静脉和颅内注射可诱发动物星形细胞瘤、胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤。在病毒自身启动子作用下JCV T抗原转基因动物可发生垂体腺瘤、恶性神经鞘瘤和髓母细胞瘤等。人体组织病理学检测结果表明,舌咽部鳞癌、食管癌、胃癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌中JCV DNA阳性率或拷贝数高于对应正常组织。JCV T抗原可通过DpSGX（2-4）pS结合到蛋白酶体SCF中的β-Trcp 1/2蛋白,干扰泛素介导的β-catenin蛋白降解,同时还可与β-catenin结合提高其蛋白稳定性并诱导其入核,核β-catenin通过上调c-myc和Cyclin D1蛋白表达促进细胞S期演进。我们前期研究结果提示,JCV T抗原过表达可以使转基因鼠发生肺癌或晶状体肿瘤。本研究拟在人体、动物、细胞和分子水平揭示JCV T抗原诱导消化系统肿瘤的病理特点和分子机理,为JCV相关消化系统肿瘤防治提供科学实验依据。研究方法:1.原代培养小鼠晶状体肿瘤细胞,获得JCV T抗原高表达的细胞模型。稳定转染JCV T shRNA,qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光检测JCV T抗原mRNA和蛋白表达;MTT和PI染色检测细胞增殖和周期;APC和PI双染检测细胞凋亡;划痕修复和Transwell检测细胞迁移和侵袭;免疫共沉淀、银染、飞行质谱和Western blot检测细胞相互作用蛋白;蛋白组学和Western blot分析T抗原表达降低后差异信号通路和蛋白。人肝癌、胰腺癌和小鼠胰腺癌细胞稳定转染pEGFP-N1-JCV T后,Western blot检测GFP和T抗原的表达;MTT检测细胞增殖和周期;APC和PI双染检测细胞凋亡;Transwell检测细胞迁移和侵袭。2.制备CAG-LacZ-T抗原loxp/loxp转基因鼠,与肝细胞特异工具鼠Alb-cre和胰腺特异工具鼠Pdx1-cre交配激活T抗原表达,鼠尾DNA PCR筛选Cre和T抗原双阳性转基因鼠,靶器官DNA PCR验证靶向LacZ的T抗原是否成功激活;CT和大体观察转基因鼠的脏器病变;HE染色观察组织病理学改变;免疫组化检测T抗原和肿瘤标志物表达;Western blot检测转基因鼠组织中相关蛋白表达。3.收集肝癌和胰腺癌组织及相应的正常组织的石蜡标本和冰冻组织,提取石蜡标本DNA,PCR和qPCR检测JCV T抗原DNA阳性率和拷贝数;提取新鲜组织蛋白,Western blot检测JCV T抗原蛋白的表达。利用石蜡标本制备组织芯片,免疫组化和原位PCR检测JC V T抗原DNA和蛋白。结果:第一部分:JC病毒T抗原对消化系统肿瘤细胞恶性表型的影响及分子机理1.稳定转染JCV T shRNA后,通过qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光检测JCV T抗原mRNA和蛋白表达均降低（P<0.05）;2.JCV T抗原低表达,抑制细胞增殖,诱导细胞G2/M期阻滞和凋亡,降低细胞迁移、侵袭、糖酵解和有氧氧化能力（P<0.05）。3.JCV T抗原可与RPL19、β-catenin、β-Trcp、NF-κB和C/EBP相互结合,但不能与Rb结合。JCV T抗原主要影响蛋白质合成和降解、能量代谢和粘附信号通路（P<0.05）。下调JCV T抗原表达促进ING2、ING5、p21、p53、Bax和p-p38蛋白表达;抑制CyclinD1、survivin、p-mTOR、VEGF、NF-κB、Akt和Bcl-2蛋白表达。4.人肝癌、胰腺癌及小鼠胰腺癌细胞中JCV T抗原过表达促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,增强细胞迁移和侵袭能力（P<0.05）。第二部分:JCV T抗原诱发转基因鼠消化系统肿瘤的病理特点和分子机理1.鼠尾DNA PCR鉴定结果显示,cre和T抗原均为阳性;靶器官DNA PCR结果显示,LacZ被切除。2.CT发现转基因鼠肝脏肿胀,体积增大。大体发现转基因鼠的肝脏、肺、脾及腹腔均有白色结节。HE染色发现肝脏、肺脏、脾脏及腹腔结节均出现癌细胞;免疫组化显示肝脏、肺脏、脾脏及腹腔结节的癌细胞均有强阳性的T抗原表达;肝癌细胞中AFP、Hep-1、β-catenin和Ki-67蛋白高表达,CEA和CK19无着色。3.与野生型鼠相比,Alb-cre/T抗原转基因鼠的肝组织中T抗原、mTOR、p-m TOR、β-catenin、Rb、β-Trcp、NF-κB和survivin蛋白表达均显著升高,同时ING2、ING4、ING5和Bax蛋白表达降低。4.CT观测发现Pdx1-Cre/T抗原鼠腹腔出现钙化灶,大体发现转基因鼠胰腺肿瘤,同时还在胃和十二指肠内发现了白色肿物。HE染色发现胰腺、前胃、胃体、胃窦及十二指肠内均发生肿瘤;免疫组化显示,胰腺、前胃、胃体、胃窦及十二指肠的肿瘤细胞均有强阳性的T抗原表达。5.与野生型鼠相比,Pdx1-cre/T抗原转基因鼠的胰腺组织中T抗原、β-catenin、Rb、β-Trcp和survivin蛋白表达升高,同时ING2、ING4、ING5、Bax、p53和p21蛋白表达降低。第三部分:JCV T抗原与人肝癌和胰腺癌发生的关系1.PCR结果显示,肝癌及正常肝脏组织均有JCV T抗原DNA整合,肝癌组织的JCV T抗原DNA阳性率明显低于正常肝脏组织（79.0%vs 84.7%,P<0.05）;胰腺癌及正常胰腺组织均有JCV T抗原DNA整合,胰腺癌组织的JCV T抗原DNA阳性率明显低于正常胰腺组织（76.0%vs 92.3%,P<0.05）。2.肝癌及正常肝脏组织中JCV T抗原DNA拷贝数无显著差异（P>0.05）;胰腺癌及正常胰腺组织中JCV T抗原DNA拷贝数也无显著差异（P>0.05）。原位PCR结果显示,肝癌及正常肝细胞核中可以检测到JCV T抗原DNA;胰腺癌及正常胰腺细胞核中也可检测到JCV T抗原DNA。3.Western blot结果表明,肝癌组织中JCV T抗原蛋白的表达水平明显高于癌旁正常组织（P<0.05）;胰腺癌组织中JCV T抗原蛋白的表达水平明显高于癌旁正常组织（P<0.05）。免疫组化结果表明,肝癌组织中可以检测到JCV T抗原蛋白核着色,癌旁正常组织中JCV T抗原无着色;胰腺癌组织可以检测到JCV T抗原蛋白核着色,正常胰腺组织中JCV T抗原无着色。结论:1.JCV T抗原通过影响蛋白质合成及分解、WNT和NF-κB等信号传导通路,调节肿瘤细胞增殖、周期、凋亡、能量代谢、迁移和侵袭。JCV T抗原促进肝癌和胰腺癌细胞生物学表型恶性转变,在消化系统肿瘤恶性演进中可能发挥作用。2.JCV T抗原诱发转基因鼠消化系统肿瘤,为T抗原参与消化系统肿瘤发生提供了直接实验依据。JC病毒T抗原通过下调抑癌基因表达,激活WNT等信号通路促进消化系统肿瘤的发生。3.JC病毒通过嵌入到人肝和胰腺细胞基因组并表达T抗原参与肝癌和胰腺癌的发生。JCV T抗原在正常和癌组织中的差异表达,是由于癌细胞更有利于JCV T抗原的转录和翻译。