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研究目的 目前乳腺癌已成为国内外女性发病率最高、死亡率第二高的恶性肿瘤,已成为重要的全球公共健康问题。作为女性肿瘤中最常见的一种,部分乳腺癌有着较高的侵袭性,危及患者生命。仍有一部分乳腺癌患者,初诊时即已出现了远处转移,这部分患者总生存率远远低于诊断时尚为早期的患者,预后较差。尽管随着基因检测、药物敏感性筛查等科学技术手段的快速发展,手术治疗、放疗、化疗与内分泌治疗等多种治疗策略日趋完善,但乳腺癌的转移仍然很难克服,是乳腺癌治疗的重大难题与挑战。因此,寻找转移相关的分子标志物、明确转移发生发展的机制,已成为乳腺癌临床与基础研究中亟待解决的迫切需求。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,lnc RNAs）是由超过200个核苷酸组成的长链转录本。由于lnc RNA有多种不尽相同的生成方式,其已成为基因组中广泛存在且非无意义的序列。虽然不具备编码蛋白的能力,但lnc RNA逐渐被发现参与并影响众多疾病的发生与进展,因此已成为近年来研究人员们关注的热点话题。研究证实,lnc RNA可通过干扰转录、影响可变剪接模式、调节蛋白质活性等方式影响蛋白编码基因,在心血管疾病、免疫相关疾病、代谢相关紊乱、细菌感染与多种肿瘤中扮演重要的角色。Lnc RNA在多种恶性肿瘤中的异常表达已经引起了许多研究者的关注,而许多lnc RNA在恶性肿瘤中所发挥的作用和具体机制仍尚未得以阐明。在本项研究中,我们探索了lnc RNA CTD-2108O9.1在乳腺癌组织与细胞中的表达水平,分析了其与临床病理特征的相关性。为明确lnc RNA CTD-2108O9.1在乳腺癌发生发展中的作用,我们进一步研究了其改变对乳腺癌细胞生物学功能表型的影响。同时,本研究深入探讨了lnc RNA CTD-2108O9.1影响乳腺癌转移的机制,为寻找乳腺癌转移诊断和治疗的潜在生物学靶点提供新的依据。研究方法 一、验证lnc RNA CTD-2108O9.1在乳腺癌中的表达:1、收集来自中国医科大学附属第一医院乳腺外科的97例乳腺癌患者组织,利用TRIzol法提取组织、乳腺正常上皮细胞系MCF-10A和乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF7及ZR-75-1的总RNA,逆转录PCR法进行反转录;2、采用real-time PCR实时定量检测组织与细胞中的lnc RNA CTD-2108O9.1表达水平。二、分析lnc RNA CTD-2108O9.1表达水平与临床病理特征的相关性:1、应用IBM SPSS Statistics V19.0进行统计分析,利用卡方检验分析乳腺癌患者组织中lnc RNA CTD-2108O9.1表达水平与临床病理资料间的相关性;三、验证lnc RNA CTD-2108O9.1对乳腺癌细胞生物学功能表型的影响:1、根据lnc RNA CTD-2108O9.1序列,分别构建过表达和敲减lnc RNA CTD-2108O9.1的载体,感染乳腺癌细胞系MDA-MB-231与MCF7后筛选稳定转染的细胞;利用荧光显微镜和real-time PCR分别定性和定量检测慢病毒转染效率,成功构建稳定表达/敲减lnc RNA CTD-2108O9.1的MDA-MB-231与MCF7乳腺癌细胞系;2、利用Transwell实验和划痕愈合实验检测lnc RNA CTD-2108O9.1对乳腺癌细胞MDA-MB-231与MCF7迁移和侵袭能力的影响;3、利用CCK8实验检测lnc RNA CTD-2108O9.1对乳腺癌细胞MDA-MB-231与MCF7增殖水平的影响;四、探索lnc RNA CTD-2108O9.1对乳腺癌细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响:1、利用相差显微镜观察过表达和敲减lnc RNA CTD-2108O9.1后的稳筛细胞系细胞形态的变化;2、提取稳筛细胞系总RNA并反转录,利用real-time PCR检测lnc RNA CTD-2108O9.1的改变对EMT相关标志物和MMP家族转录水平的影响;3、提取稳筛细胞系全蛋白,利用western blotting检测lnc RNA CTD-2108O9.1的改变对EMT相关标志物和MMP家族蛋白水平的影响;4、利用免疫荧光染色实验检测lnc RNA CTD-2108O9.1的改变对EMT相关标志物和MMP家族的影响;5、利用real-time PCR检测EMT相关标志物和MMP家族在乳腺癌患者组织标本中的表达水平;6、利用TRAP实验分离与lnc RNA CTD-2108O9.1直接结合的分子,应用real-time PCR检测MMP家族和EMT相关标志物与lnc RNA CTD-2108O9.1的结合情况;7、应用皮尔森相关系数分析乳腺癌患者组织中EMT相关标志物和MMP家族表达水平与lnc RNA CTD-2108O9.1表达水平间的相关性;五、探索lnc RNA CTD-2108O9.1与潜在靶基因白血病抑制因子受体（leukemia inhibitory factor receptor,LIFR）间的相关性:1、利用real-time PCR检测LIFR在乳腺癌患者组织标本中的转录水平表达情况;2、应用皮尔森相关系数分析乳腺癌患者组织中LIFR与lnc RNA CTD-2108O9.1转录水平表达间的相关性;3、提取乳腺癌患者组织标本全蛋白,利用western blotting检测组织中LIFR与lnc RNA CTD-2108O9.1蛋白水平的表达相关性;4、利用real-time PCR和western blotting分别检测lnc RNA CTD-2108O9.1对LIFR转录水平和蛋白水平的影响;5、利用western blotting和RNA pulldown检测lnc RNA CTD-2108O9.1是否通过结合EIF4G1影响LIFR蛋白的翻译;六、探索lnc RNA CTD-2108O9.1是否通过作用于LIFR影响乳腺癌转移:1、在过表达lnc RNA CTD-2108O9.1的稳筛乳腺癌细胞系中敲减LIFR;2、利用Transwell实验和划痕愈合实验检测LIFR是否能恢复lnc RNA CTD-2108O9.1对乳腺癌细胞MDA-MB-231与MCF7迁移和侵袭能力的影响;七、通过在体实验证明lnc RNA CTD-2108O9.1通过作用于LIFR影响乳腺癌转移:1、利用裸鼠脂肪垫种植和裸鼠尾静脉注射分别构建过表达和敲减lnc RNA CTD-2108O9.1以及过表达lnc RNA CTD-2108O9.1后敲减LIFR的裸鼠原位异种移植模型和裸鼠肺定植转移模型;2、8周后利用PET扫描检测肺定植转移模型中肿瘤在肺部的转移情况;3、记录肿瘤生长状况,8周时处死裸鼠,测量肿瘤大小与重量,分析肿瘤生长和转移与lnc RNA CTD-2108O9.1和LIFR的相关性。研究结果 一、Lnc RNA CTD-2108O9.1在乳腺癌中的表达:1.在97例乳腺癌患者组织中,相对于癌旁非癌组织,lnc RNA CTD-2108O9.1在癌组织中普遍低表达（86/97,P<0.001）;2.相对于人正常乳腺上皮细胞MCF-10A,lnc RNA CTD-2108O9.1在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中相对表达量为MCF-10A的0.40±0.03倍（P<0.001）、MCF7相对表达量为0.33±0.04倍（P<0.001）及ZR-75-1为0.22±0.04倍（P<0.001）,均为显著低表达;二、Lnc RNA CTD-2108O9.1表达水平与临床病理特征和预后的相关性:1.Lnc RNA CTD-2108O9.1在乳腺癌组织中的低表达与淋巴结转移呈正相关（P=0.023）,与年龄（P=0.087）、肿瘤大小（P=0.584）、ER（P=0.387）、PR（P=0.089）、HER2（P=0.272）、Ki67（P=0.383）和分子亚型（P=0.177）间无显著的统计学相关性;三、Lnc RNA CTD-2108O9.1对乳腺癌细胞生物学功能表型的影响:1.经稳定转染,real-time PCR检测在过表达lnc RNA CTD-2108O9.1的MDA-MB-231细胞中lnc RNA CTD-2108O9.1上调142.2±16.4倍（P<0.001）,在MCF-7细胞中上调99.4±22.7倍（P=0.002）;在敲减lnc RNA CTD-2108O9.1的MDA-MB-231细胞中lnc RNA CTD-2108O9.1表达量下调至0.15±0.21倍（P=0.002）,MCF-7细胞中lnc RNA CTD-2108O9.1下调至0.59±0.10倍（P=0.002）;2.过表达lnc RNA CTD-2108O9.1抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF7的迁移和侵袭:Transwell迁移实验中,与OE-NC组相比,OE-2108O9.1组MDA-MB-231细胞迁移能力显著降低（303±35 vs.201±38,P=0.027）,OE-2108O9.1组MCF-7细胞迁移能力显著降低（133±24 vs.64±8,P=0.009）;Transwell侵袭实验中,与OE-NC组相比,OE-2108O9.1组MDA-MB-231细胞侵袭能力显著降低（109±11 vs.71±6,P=0.006）,OE-2108O9.1组MCF-7细胞侵袭能力显著降低（83±13vs.44±17,P=0.034）;划痕愈合实验中,与对照组OE-NC相比,OE-2108O9.1组MDA-MB-231和MCF-7细胞划痕愈合速度降低。3.敲减lnc RNA CTD-2108O9.1促进乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF7的迁移和侵袭:Transwell迁移实验中,与KD-NC组相比,KD-2108O9.1组MDA-MB-231细胞迁移能力显著提高（171±19 vs.251±38,P=0.032）,KD-2108O9.1组MCF-7细胞迁移能力显著增强（92±10 vs.165±31,P=0.009）;Transwell侵袭实验中,与KD-NC组相比,KD-2108O9.1组MDA-MB-231细胞侵袭能力显著增强（130±16 vs.214±15,P=0.003）,KD-2108O9.1组MCF-7细胞侵袭能力显著提高（73±3 vs.101±14,P=0.028）;划痕愈合实验中,与对照组KD-NC相比,KD-2108O9.1组MDA-MB-231和MCF-7细胞划痕愈合速度加快。四、Lnc RNA CTD-2108O9.1对乳腺癌细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响:1.相差显微镜摄片显示,过表达lnc RNA CTD-2108O9.1的乳腺癌细胞形状缩短变钝,而敲减lnc RNA CTD-2108O9.1的细胞形状拉长变为长梭形;2.在乳腺癌细胞中过表达lnc RNA CTD-2108O9.1后,MMP2（0.58±0.29,P<0.01）、MMP9（0.73±0.22,P<0.01）和α-SMA（0.63±0.11,P<0.01）的RNA水平表达显著下调,laminin的RNA表达显著提高（1.69±0.20,P<0.01）;laminin、ZO-1和cytokeratin的蛋白水平表达提高,MMP2、MMP9、N-cadherin、vimentin和β-catenin的蛋白水平表达下调,β-catenin核堆积减少;3.在乳腺癌组织中lnc RNA CTD-2108O9.1的表达水平与laminin呈中度相关（r=0.488,P<0.01）,与β-catenin（r=0.334,P=0.001）、N-cadherin（r=0.261,P=0.024）、Twist1（r=0.244,P=0.017）和SNAI1（r=0.282,P=0.011）呈弱相关;4.TRAP-q PCR结果提示,MMP-2、MMP-9、laminin、N-cadherin和β-catenin能与lnc RNA CTD-2108O9.1直接结合;五、Lnc RNA CTD-2108O9.1与潜在靶基因白血病抑制因子受体（leukemia inhibitory factor receptor,LIFR）间的相关性:1.LIFR在乳腺癌组织中与癌旁非癌组织相比显著低表达（84/97,P<0.001）;2.在乳腺组织中,LIFR的RNA表达水平与lnc RNA CTD-2108O9.1的表达水平仅呈弱相关（r=0.393,P<0.01）,但其蛋白表达水平与lnc RNA CTD-2108O9.1的表达相关;3.当过表达或敲减lnc RNA CTD-2108O9.1后,乳腺癌细胞中的LIFR蛋白水平表达与lnc RNA CTD-2108O9.1变化呈正相关,但LIFR的RNA水平表达无显著变化（P>0.05）。4.过表达lnc RNA CTD-2108O9.1后,EIF4G1的蛋白水平表达上调;RNA pulldown结果显示EIF4G1能直接与lnc RNA CTD-2108O9.1结合;六、Lnc RNA CTD-2108O9.1是否通过作用于LIFR影响乳腺癌转移:1.Transwell迁移实验中,过表达lnc RNA CTD-2108O9.1使MDA-MB-231细胞迁移能力降低（220±23 vs.168±16,P=0.033）,加以敲减LIFR使迁移能力恢复（192±6 vs.271±13,P=0.001）,MCF-7四组细胞也有相同变化（129±32 vs.69±4 vs.62±11 vs.87±9）,过表达lnc RNA CTD-2108O9.1使细胞迁移能力下降后（P=0.031）,再次敲减LIFR能使迁移能力恢复（P=0.038）;2.Transwell侵袭实验中,在OE-2108O9.1与OE-NC组MDA-MB-231（185±14 vs.156±7,P=0.032）和MCF-7（85±11 vs.53±8,P=0.020）相比侵袭力降低后,OE-2108O9.1+sh-LIFR组MDA-MB-231（153±12 vs.220±20,P=0.008）和MCF-7（31±19 vs.82±7,P=0.012）细胞侵袭能力和OE-2108O9.1+sh-NC组相比又有所提高;3.划痕愈合实验中,MDA-MB-231和MCF-7细胞因lnc RNA CTD-2108O9.1受抑制的划痕愈合速度均在敲减LIFR后恢复。七、Lnc RNA CTD-2108O9.1通过作用于LIFR影响乳腺癌在体肿瘤的转移:1.相比于LV-NC组肺定植转移灶的SUVmax（0.70±0.10）,OE-2108O9.1组的SUVmax（0.49±0.07）下降（P=0.039）,而敲减LIFR后的OE-2108O9.1+sh-LIFR组SUVmax（0.59±0.04）提高（P=0.081）;但三组原位异种移植裸鼠模型的原位肿瘤生长、肿瘤大小无显著差异（P>0.05）;2.敲减lnc RNA CTD-2108O9.1的KD-2108O9.1组SUVmax（1.20±0.19）高于LV-NC组（0.70±0.10,P=0.016）,恢复LIFR表达后的KD-2108O9.1+LIFR组的SUVmax（0.85±0.02）降低（P=0.034）;但对原位肿瘤的生长无显著作用（P>0.05）。研究结论 一、lnc RNA CTD-2108O9.1在乳腺癌组织和细胞中普遍低表达;二、lnc RNA CTD-2108O9.1在乳腺癌组织中的低表达与淋巴结转移相关;三、过表达lnc RNA CTD-2108O9.1抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF7的迁移和侵袭,对增殖和周期无显著影响;四、敲减lnc RNA CTD-2108O9.1促进乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF7的迁移和侵袭,对增殖和周期无显著影响;五、过表达lnc RNA CTD-2108O9.1抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231中MMP家族表达和EMT;六、EMT相关标志物中,laminin与lnc RNA CTD-2108O9.1在乳腺癌患者组织中表达呈中度相关,β-catenin、N-cadherin、Twist1和Snail与其弱相关;七、LIFR在乳腺癌组织和细胞中普遍低表达;八、Lnc RNA CTD-2108O9.1能通过直接结合EIF4G1调控LIFR蛋白水平的表达;九、Lnc RNA CTD-2108O9.1通过调控LIFR影响乳腺癌转移;