单纯性马蹄内翻足(Idiopathic congenital talipes equinovarus，ICTEV)是常见的严重危害儿童健康的先天畸形之一，发病率在1～8‰。遗传因素在ICTEV的发病过程中发挥重要作用，其遗传度为65％。但其遗传方式、外显率等均不清楚，易感基因尚未确定。目前研究较多的与ICTEV发病相关的基因主要集中在与足踝部骨骼、软骨、肌肉和神经发育相关的基因，如COL9A1，CASP10，WNT7A，HOXD13，GLI3等。我们课题组前期应用ETDT方法对84例ICTEV核心家系Collagen typeⅨ，alphal(COL9A1)基因簇内的7个多态位点进行分析，提示COL9A1基因可能是ICTEV的易感基因。通过对25例ICTEV患儿肌肉及肌腱组织COL9A1基因mRNA及蛋白水平的表达情况进行研究，结果显示患儿COL9A1表达明显增加。用PCR-SSCP方法进行COL9A1基因近端启动子突变筛查，亦没有发现突变。之后我们分别构建了COL9A1基因近端启动子系列截短荧光素酶报告基因载体，转染Bel细胞系、823细胞系、人成纤维细胞系，转染结果提示：COL9A1基因上游-559到-403之间、-275到-195之间可能存在着正调控元件。接着缺失型及突变型荧光素酶表达载体荧光素酶活性检测结果提示：COL9A1基因近端启动子的-257至-275之间可能是COL9A1基因的正调控元件，又应用P-MATCH软件预测此区域有转录因子SRY-related high mobility group box gene9(SOX9)的结合位点。　　 SOX9基因是SOX基因家族中重要的一员，作为转录因子，其在脊椎动物生长发育过程中起着重要的作用，尤其在人和哺乳动物性别决定和软骨生成中起着关键的调控作用。人的SOX9基因定位于17q23，其转录产物长4.3kb，编码含509个氨基酸分子量为56kDa的蛋白。1994年，SOX9作为躯干发育异常(Camptomelicdysplasia CD)致病基因被鉴定出来。如果SOX9发生突变或SOX9基因的单倍体不足就可以导致CD。CD是一种罕见的先天性软骨发育异常综合症(国外报道发病率为0.5～1/10万)，表现为骨骼发育障碍伴随XY性别逆转，属常染色体显性遗传病。SOX9在骨和软骨发育中起关键作用。体内、外实验证明：在人软骨细胞中，SOX9能以转录因子形式结合COL2A1、COL9A1、COL27A1或软骨基质蛋白-1基因(Matrilin-1)等基因上游相应SOX9结合位点，从而来调控其基因的表达，这种结合是通过位于SOX9蛋白N端附近二聚体域介导的，而不是HMG域。此区域突变降低了它们的结合力从而导致CD。　　 本研究旨在探索SOX9基因是否与ICTEV畸形发生相关，SOX9蛋白能否与COL9A1上游预测的结合位点结合，以及在ICTEV发生过程中SOX9基因是否受其它基因的调控。　　 方法：　　 标本：84例ICTEV患者外周静脉血和15例ICTEV患者足踝部肌肉组织(主要为()长屈肌)标本由中国医科大学附属第二临床医院小儿外科提供，9例同龄正常对照(非ICTEV患者)足踝部肌肉组织(主要为()长屈肌)由中国医科大学法医学院提供。2例踝关节开放型外伤患者清创剔除的部分肌肉及软骨组织由沈阳市奉天医院骨外科提供。所有标本使用均经患者知情并同意。　　 1、用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)检测SOX9基因外显子及转录起始点上游1100bp序列突变　　 PCR扩增84例患者SOX9基因2个外显子以及SOX9基因转录起始点上游1100bp序列，应用20%～80%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳筛查上述片段突变情况。　　 2、分别用RT-PCR、real-time RT-PCR方法、免疫组织化学染色和Western-Blotting方法在mRNA及蛋白表达水平上研究SOX9基因在ICTEV患者足踝部肌肉表达情况　　 分别提取ICTEV患者及对照足踝部肌肉组织的RNA，应用RT-PCR及real-time RT-PCR方法检测SOX9基因mRNA的表达。制作ICTEV患者及对照足踝部肌肉组织切片，应用免疫组织化学染色技术，观察SOX9蛋白的表达部位；分别提取ICTEV患者及对照足踝部肌肉组织总蛋白，应用Western-Blotting检测SOX9蛋白的表达情况。　　 3、用激光扫描共聚焦显微镜观察SOX9与COL9A1蛋白在ICTEV患者足踝部肌肉组织的表达　　 制作ICTEV患者及对照足踝部肌肉组织冰冻切片，经常规处理后用SOX9兔多克隆抗体及COL9A1鼠多克隆抗体共杂交，用FITC标记羊抗兔荧光二抗及TRITC标记羊抗鼠荧光二抗杂相应抗体，应用激光扫描共聚焦显微镜同时观察SOX9蛋白及COL9A1蛋白的表达部位。　　 4、用染色质免疫沉淀实验(ChIP)在体内验证SOX9蛋白与COL9A1基因启动子区预测SOX9结合位点结合作用　　 将踝关节外伤患者清创剔除的肌肉及软骨组织分别直接匀浆处理，甲醛交联、酶切后应用SOX9抗体进行沉淀，沉淀下来DNA通过PCR扩增检测结果。　　 5、用凝胶迁移实验(EMSA)在体外验证SOX9蛋白与COL9A1基因启动子区预测SOX9结合位点结合作用　　 将踝关节外伤患者清创剔除的肌肉和软骨组织核蛋白分别和3’生物素标记的COL9A1基因启动子区预测SOX9结合位点探针，在凝胶阻滞缓冲液中室温结合1小时，10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜、紫外交联后，应用化学发光检测系统检测结果。　　 6、用P-Match软件预测人SOX9基因5’上游序列转录因子的结合位点　　 获取人SOX9基因上游1200bp5’侧翼序列信息(http：//www.ensembl.org)，应用P-Match软件预测其转录因子结合位点。　　 7、用荧光素酶报告基因技术检测SOX9基因启动子系列截短荧光素酶表达载体荧光素酶活性　　 PCR扩增人SOX9基因启动子区域依次截短的启动子序列，构建荧光素酶报告基因表达载体pGL3-SOX9。瞬时转染人RD细胞，观察各载体荧光素酶活性。　　 8、用荧光素酶报告基因技术检测SOX9基因启动子系列截短荧光素酶表达载体与结合位点突变荧光素酶表达载体荧光素酶活性　　 为了检测上述3个结合位点在相应调控区的作用，我们将构建的SOX9基因启动子系列截短荧光素酶表达载体与结合位点突变荧光素酶表达载体转染RD细胞，观察各载体荧光素酶活性。　　 9、用染色质免疫沉淀实验(ChIP)在体内验证HOXD13与SOX9基因启动子区预测HOXD13结合位点结合作用　　 将踝关节外伤患者清创剔除的肌肉组织直接匀浆处理，甲醛交联、酶切后应用HOXD13抗体进行沉淀，沉淀下来DNA通过PCR扩增检测结果。　　 10、用凝胶迁移实验(EMSA)在体外验证HOXD13与SOX9基因启动子区预测HOXD13结合位点结合作用　　 踝关节外伤患者清创剔除的肌肉组织核蛋白和3’生物素标记的SOX9基因启动子区预测HOXD13结合位点探针(含有位点3)在凝胶阻滞缓冲液中室温结合1小时，10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜、紫外交联后，应用化学发光检测系统检测结果。　　 11、用荧光素酶报告基因技术检测HOXD13低表达时Luc-3P及Luc-3M荧光素酶表达载体荧光素酶活性　　 化学合成HOXD13基因的siRNA与Luc-3P或Luc-3M共转染RD细胞，转染48h后收集细胞，然后按双荧光素酶活性检测试剂盒说明进行荧光素酶活性测定。　　 12、用Real-time RT-PCR方法观察HOXD13基因表达下调时，SOX9及COL9A1基因的mRNA表达水平改变　　 化学合成HOXD13基因的siRNA，转染RD细胞后，通过Real-time RT-PCR的方法检测SOX9及COL9A1基因mRNA表达水平的改变。　　 结果：　　 1、在84例ICTEV患者外周静脉血中未发现SOX9基因1、2外显子及转录起始点上游1100bp范围内存在突变。　　 2、不论在mRNA水平，还是在蛋白水平，ICTEV患者足踝部肌肉组织中存在(12/15，80%)SOX9基因表达上调并且患者在mnRNA表达水平升高的与在蛋白表达升高的相一致。　　 3、激光扫描共聚焦显微镜显示SOX9与COL9A1在ICTEV患者足踝部肌肉组织同时存在于肌膜、肌内膜、肌外膜的结缔组织中且二者位置重合，提示二者可能在ICTEV患者足踝部肌肉组织中存在某种关系。　　 4、ChIP实验显示在肌肉及软骨组织中SOX9蛋白均可以和COL9A1基因启动子区预测SOX9结合位点直接结合。　　 5、EMSA实验显示在体外SOX9蛋白可以和COL9A1基因启动子区预测SOX9结合位点直接结合。　　 EMSA结果表明当肌肉及软骨核蛋白存在时出现阻滞的DNA-蛋白质复合体，当加入SOX9抗体时出现超阻滞条带。证明在体外SOX9和COL9A1基因启动子区预测的SOX9结合位点直接结合。　　 6、人SOX9基因5’侧翼序列启动子区域存在不同的调控因子，利用P-Match软件预测后发现3个HOXD13的可能结合位点，分别命名为HOXD13结合位点1、HOXD13结合位点2和HOXD13结合位点3。　　 7、将以SOX9基因5’侧翼序列1200bp内预测的3个HOXD13结合位点的位置设计5个截短荧光素酶表达载体转染RD细胞后，各载体荧光素酶活性检测结果　　 实验显示在SOX9基因5’上游-1158bp至-770bp之间(即含有HOXD13结合位点1)区域存在负调控区；在SOX9基因5’上游-770bp至-512bp之间(即含有HOXD13结合位点2)区域存在正调控区；在SOX9基因5’上游-512bp至-368bp之间(即含有HOXD13结合位点3)区域存在负调控区。　　 8、SOX9基因启动子系列截短荧光素酶表达载体与结合位点突变荧光素酶表达载体荧光素酶活性的比较结果　　 为了检测上述3个结合位点在相应调控区的作用，我们将构建SOX9基因启动子系列截短荧光素酶表达载体与结合位点突变荧光素酶表达载体转染RD细胞，结果在RD细胞系中Luc-1M(结合位点1核心序列突变)与Luc-1P相比启动子活性升高了0.4倍；Luc-2M(结合位点2核心序列突变)与Luc-2P相比启动子活性下降了0.4倍；Luc-3M(结合位点3核心序列突变)与Luc-3P相比启动子活性升高了3.2倍。说明位点1、3起负调控作用，而位点2起正调控作用。　　 9、ChIP结果显示在肌肉组织内HOXD13蛋白可以和SOX9基因启动子区预测的3个HOXD13结合位点中位点3直接结合。　　 10、EMSA结果显示在体外HOXD13蛋白可以和SOX9基因启动子区预测HOXD13结合位点3直接结合。　　 EMSA结果表明当肌肉核蛋白存在时出现阻滞的DNA-蛋白质复合体，当加入HOXD13抗体时出现超阻滞条带，证明在体外HOXD13和SOX9基因上游预测的HOXD13结合位点3直接结合。　　 11、HOXD13低表达时，Luc-3P及Luc-3M荧光素酶表达载体荧光素酶活性比较结果　　 用siRNA-HOXD13-1180分别与Luc-3P及Luc-3M荧光表达载体转染RD细胞，当HOXD13低表达时，Luc-3P启动子活性比转染无义序列的活性相比升高了7.7倍；而Luc-3M启动子活性与转染无义序列的活性相比只升高了0.9倍。说明当HOXD13低表达时结合在SOX9基因上游负调控区的HOXD13减少，从而增加SOX9基因启动子活性。　　 12、HOXD13基因低表达时，SOX9基因表达轻微上调而同时COL9A1基因两个转录本表达都显著上调　　 将s1RNA-HOXD13-1180瞬时转染RD细胞，发现细胞的SOX9基因表达轻微上调而同时COL9A1基因两个转录本表达都显著上调，说明HOXD13很可能是SOX9基因的负调控因子。　　 结论：　　 1、SOX9蛋白能与COL9A1基因近端启动子-257至-275bp之间正调控元件结合，从而调控COL9A1基因的表达，而使其表达上调，这可能与ICTEV畸形发生相关。　　 2、SOX9基因的编码区及5’侧翼序列突变可能不是ICTEV发病的原因。　　 3、无论是mRNA水平还是蛋白水平SOX9基因在ICTEV患者肌肉标本(12/15，80%)表达都明显升高，这可能与ICTEV畸形发生相关。　　 4、HOXD13基因低表达使SOX9基因表达上调，SOX9基因高表达从而导致COL9A1基因表达上调，此机制可能参与ICTEV畸形的发生。