前言单纯性马蹄内翻足(idiopathic congenital talipes equinovar，ICTEV)是一种出生时即可见的复杂的先天性足畸形。在不同的人群中，ICTEV的发病率有很大差异，在我国约为0.6‰～1‰，男女之比约为2～2.5：1。近年来，国内外对于ICTEV的发病机制争论较多，但均缺乏有力的证据。临床资料和流行病学研究表明，遗传因素在ICTEV的发病过程中发挥重要的作用，但其遗传方式、外显率等均不清楚。目前认为ICTEV主要是在肢芽发育的易损期，由于遗传因素和环境因素的共同作用，某些与肢体发育有关的基因及其产物出现异常的结果。近年来，国内外对ICTEV致病基因的分子水平上的研究很少，研究多集中于对一些合并有类似足部畸形的综合征和多发畸形的研究。这些研究提供了ICTEV致病基因可能的侯选区域：5q15-31.1；6q12-13；7号染色体长臂；17号染色体长臂；10p11.2-15；9号染色体中心粒周围区等，通过生物信息学可知这些区域内存在着一些与骨骼、肌肉、肌腱、神经发育相关的基因，这为我们探寻ICTEV的易感基因提供了有利的线索。目前的研究表明，在ICTEV患侧组织中存在纤维组织明显增加，其中Ⅰ型胶原增加最显著。Ⅰ型胶原是由两条α1链及一条α2链组成的三股螺旋结构。Ⅰ型胶原的α1链和α2链分别由COL1A1和COL1A2基因编码。COL1A1基因和COL1A2基因分别位于17q21.3-q22和7q21.3-q22。目前已发现上百种COL1A1基因突变，主要集中在外显子。COL1A1基因突变可导致多种疾病的发生，主要可引起先天性成骨不全、Ehlers Dahlos综合征(EDS)、骨质疏松症(Osteoporosis)。但是对于COL1A1基因与ICTEV相关性的进一步研究至今仍未见报道。本研究以COL1A1基因为候选基因，将从分子水平上进一步探讨Ⅰ型胶原基因与ICTEV发生的相关性。为了从RNA水平上进一步观察ICTEV中的COL1A1基因表达水平的变化，本研究中我们首先构建了马蹄内翻足大鼠模型，并采用半定量RT-PCR的方法，对后肢发育不同时期的模型胎鼠和正常胎鼠后肢组织中Collal基因的表达水平进行了比较。接下来，我们又采用半定量RT-PCR方法，对20例ICTEV患儿和4例正常儿童的肌肉和肌腱组织中COLlAl基因的表达水平进行了比较。此外，为了探讨COLlAl基因表达水平变化的原因，我们选择了COLlAl基因转录起始点上游-1031bp～+30bp和第1内含子，对84例ICTEV患者进行了突变筛查。材料与方法一、研究对象：Wistar大鼠86只，包括雌鼠65只和雄鼠21只，均购自校动物部。肌肉及肌腱标本来自于20例手术矫正的ICTEV患儿，取4例外伤及尸检患儿相应组织作为正常对照，所有标本均经患者知情同意。84例单纯性马蹄内翻足患者的静脉抗凝血，标本由中国医科大学第二临床医院小儿外科提供。其中男性60例，女性24例(男女之比为2.5：1)；年龄最大者28岁，最小者4个月；单侧马蹄内翻足者51例，双侧马蹄内翻足者33例(双侧者占39.28％)；所有患者均具有典型的临床症状，经X线和手术确诊。100例正常人DNA，研究对象均来自中国东北地区正常汉族人群。二、实验方法1、大鼠模型的构建及半定量RT-PCR检测模型鼠后肢Collal基因的表达(1)构建大鼠模型通过在孕十天给孕鼠灌全反式维甲酸(135mg／kg体重)和矿物油分别获得马蹄内翻足模型胎鼠及正常对照胎鼠。(2)观察Collal基因在动物模型中的表达情况分别取孕15天，17天，19天及21天的实验组和对照组胎鼠的后肢，常规提取总RNA并进行反转录得到cDNA，以β-actin为内对照采用半定量RT-PCR方法研究Collal基因在后肢发育不同阶段的表达情况。2．半定量RT-PCR分析COLlAl基因在患儿及正常对照肌肉、肌腱组织中的表达(1)按常规方法提取患儿及正常对照肌肉、肌腱组织中的总RNA，并进行反转录得到cDNA。(2)以β-actin为内对照采用半定量RT-PCR方法研究COLlAl基因在患儿及正常对照肌肉、肌腱组织中的表达情况。3．PCR-DGGE(1) PCR扩增明确COLlAl基因上游转录调控区和第1内含子的基因序列，并应用Primer5软件设计引物(上海生工合成)，在上游引物的5′端加上40bp的[GC]夹。对84名单纯性马蹄内翻足患者DNA目的片段进行PCR扩增，并用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。(2) DGGE检测以变性剂浓度范围为20％—80％的聚丙烯酰胺凝胶做水平DGGE，并根据带形及其位置进一步调节变性剂浓度范围及电泳时间；电泳后，下胶，溴化乙锭染色，在紫外灯下观察结果。(3)确定突变位点对电泳带形异常的PCR产物进行DNA测序以确定序列改变的位置与性质，并对正常人DNA的相同位点进行筛查，以判断该碱基置换是突变还是多态。实验结果一、模型胎鼠RT-PCR结果RT-PCR结果显示在模型胎鼠后肢发育的各个时期均存在Collal基因表达的上调。二、人COLlAl基因RT-PCR结果ICTEV患儿肌肉及肌腱组织中COLlAl基因表达水平高于正常组织。三、PCR-DGGE检测结果经DGGE筛查并测序发现一名患者-161bp处存在C→T的杂合突变，另一名患者+274bp处存在C→G的纯合突变。分别经过对100名正常人的同一位点进行筛查，没有发现相同的改变，排除其为多态。经查找人类基因突变数据库(The Human Gene Mutation Database，HGMD)，证实是尚未见报道的新突变。结论1、应用半定量RT-PCR的方法发现在马蹄内翻足模型胎鼠后肢发育的不同时期均存在Collal基因表达的上调，同时发现单纯性马蹄内翻足患儿患侧肌肉及肌腱组织中COLlAl基因表达水平高于正常组织，证明了该基因与马蹄内翻足畸形的发生具有相关性。2、在COLlAl基因-161bp处和+274bp处发现了新突变，提示该基因转录调控序列的突变可能是ICTEV的致病原因之一。