镰刀菌介导的海南龙血树结竭转录组分析及DcTIFY基因的克隆表达分析

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血竭主要来源于龙血树属植物所形成的红褐色树脂,是一种名贵中药材。海南龙血树(Dracaena cambodiana),是天门冬科(Asparagus)龙血树属(Dracaena)常绿植物,是我国特有的血竭基源植物。血竭的主要药效物质是海南龙血树在损伤和微生物侵染下作用下形成的具有防御作用的黄酮类、萜类、茋类、甾体类次生代谢产物。茉莉酸(jasmonic acid,JA)信号途径参与植物的生长发育和应激反应,在植物次生代谢产物的合成中也发挥重要作用。TIFY10/JAZ是植物茉莉酸信号转导中发挥关键作用的调控因子。本研究通过对禾谷镰刀菌接种的海南龙血树茎干的转录组高通量测序,筛选海南龙血树中与血竭合成与调控相关的基因,为进一步探明海南龙血树血竭形成过程中代谢机制,也为“微生物-龙血树互作生成血竭”研究模型的建立奠定基础;通过对DcTIFY10的克隆与表达,分析其在海南龙血树血竭形成过程中的作用,为进一步研究茉莉酸信号途径在海南龙血树生长发育和血竭形成过程中的作用提供技术支持。通过DNA条形码技术鉴定国内血竭的主要基源植物海南龙血树和剑叶龙血树,发现ITS2和trn L-trn F可作为鉴定的分子标记,并构建了分子标记的示意图。基于两种龙血树的ITS2序列与同源的41个物种的ITS2序列构建了分子进化树,发现龙血树属植物与龙舌兰科、百合科组成分支的亲缘关系近于含有天门冬科的分支,此结果为海南龙血树和剑叶龙血树的种质资源鉴定提供了分子标记,并为龙血树属在百合纲确切分类地位的确定提供了理论和技术支持。首次完成了微生物诱导海南龙血树的转录组测序,获得了大量的转录组数据,所有样品测序共获得总碱基数179.50Gb,共获取了601394612条Clean reads,GC含量介于47.02%-51.90%之间,Q30均在89.33%以上。从转录组数据与指定的参考基因组序列比对结果统计来看,各样品的Reads与参考基因组的比对效率在80.68%。通过DESeq软件共获得133445条差异基因;将其在各数据库中比对,共注释127198条差异基因。通过生物信息学方法首次从海南龙血树转录组数据库中鉴定了4个海南龙血树DcTIFY10基因。DcTIFY10a包含549个核苷酸,编码182个氨基酸;DcTIFY10b包含534个核苷酸,编码177个氨基酸;DcTIFY10c包含681个核苷酸,编码227个氨基酸;而DcTIFY10d包含738个核苷酸,编码246个氨基酸。4个DcTIFY10蛋白的相对分子量在19.64 k D~26.24 k D,等电点为6.43~9.22。4个DcTIFY10蛋白均具有TIFY10的特征性ZIM和Jas结构域,对4个DcTIFY10蛋白与其他物种进行系统进化树分析,发现4个DcTIFY10蛋白与水稻、拟南芥的TIFY10具有较近的亲缘关系。运用实时荧光定量PCR进行4个DcTIFY10的表达分析,4个DcTIFY10基因在海南龙血树根或者茎中的表达量最高,在血竭诱导生成过程中持续上调表达,与血竭的生成部位和形成时间呈现出一致性,说明4个DcTIFY10基因均参与了血竭的形成过程,这一结果为进一步研究茉莉酸信号途径在海南龙血树生长发育和血竭形成过程中的作用提供了技术支持。
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