论文部分内容阅读
在我国,胆囊结石病是一种常见的普通外科疾病,全世界的患病率约为15%左右,它是引起重症胆道感染的主要原因,与急性重症胰腺炎的关系十分密切,更是胆囊癌形成和发展的潜在因素。胆囊结石成因的分子机制尚未完全明了,目前普遍认为是遗传因素、环境因素共同作用的结果。近年来国内外学者对胆囊结石形成机制的探索和研究最终形成了三个一致的基本共识,已经成为胆石病的经典假说：① 胆汁中胆固醇过饱和,是胆囊结石发生的必要条件与胆石形成的基础；② 胆汁中促/抗成核因子平衡的破坏,导致胆固醇单水结晶的形成；③ 胆囊动力异常及功能的障碍,参与并促进胆囊结石的发生。miRNAs近些年来已被证实来对许多疾病具有调控作用,但是在胆囊结石病中,尚未见到相关报道。因此,本研究采用第二代高通量测序技术通过对胆囊结石患者胆囊粘膜中mRNA和niRNA表达谱的检测及生物信息学的分析,初步了解niRNAmRNA在其可能的发生发展中的作用机制,并在体外细胞模型中对其分子机理进行初步的探索。1,利用Hiseq deep sequencing新一代高通量深度测序技术对胆囊结石和胆囊息肉患者的胆囊上皮样本中mRNA进行检测,比对Genebank数据库,检测了mRNA表达情况,利用DAVID网站整合数据库对2倍法筛选的差异基因进行基因本体学(GO)、 KEGG信号通路KEGG pathway)分析,对差异基因的功能富集情况和信号通路富集情况进行描述。2,以上述同样总RNA为材料,使用Hiseq高通量测序法建立miRNA文库,获取miRNA的表达谱。对比miRBase数据库,利用targetscan网站提供的预测数据库,对2倍法筛选的miRNA差异基因进行靶基因预测。对预测获得的靶基因利用DAVID网站进行GO及KEGG信号通路分析,对预测靶基因的功能富集情况和信号通路富集情况进行描述。3,对比分析miRN A和mRNA两者之间表达差异的基因(差异表达miRNA的定义为：Fold-change>1或者Fold-change<-1,并且p-value<0.01;差异表达mRNA的定义为：FDR≤0.001且倍数差异在2倍及以上的基因),采用生物信息学的方法,分析并构建了构建胆囊结石差异miRNA和mRNA表达谱及调控网络,筛选验证研究方向。4,应用Real-time PCR方法,随机验证了miRNA和mRNA在胆囊结石和胆囊息肉患者的胆囊上皮组织中的表达情况,对高通量测序数据的可靠性和准确性进行验证。5,对筛选出的miRNA和mRNA,通过双荧光素酶报告基因法,在体外细胞模型中过表达miRNA等方法进一步分析其调控机制。同时利用western-blot方法对筛选出的信号通路进行初步的检测,为后续的研究提供基础。结果：1,胆囊结石和胆囊息肉mRNAs的Hiseq高通量测序比对高通量测序结果显示,差异表达的mRNA差异基因共有525条。GO分析发现,这些基因在细胞发育、结构发育、细胞过程调节、细胞粘附、细胞组分机化调控方面具有重要作用。KEGG信号通路分析发现具有显著性差异的为WNT、MAPK、PI3K/AKT等癌细胞信号通路,离子转运通路,胰岛素相关通路等。2,胆囊结石和胆囊息肉miRNAs的Hiseq高通量测序比对miRNA表达谱中共有差异基因17个,通过targetscan网站获得预测靶基因1962个,通过DAVID网站分析发现,预测靶基因在发育过程,生物调节,细胞过程,细胞组分机化,生长,生物粘附等方面有富集；KEGG通路分析提示,基因富集具有显著性差异的通路总计29条,去除与肿瘤相关的通路后共剩余16条通路。其中大部分在ABC转运蛋白家族方面均有研究,ABC转运调控通路富集最为显著。通过miranda v3.3a软件预测显著性差异表达的17个miRNAs的靶基因,发现几乎每个miRNA都对应众多的靶基因,我们最终选取所预测的target中energy最低的10个基因构建了miRNA及其靶基因的调控网络。3,胆囊结石和胆囊息肉中mRNA和miRNA联合分析结合差异表达mRNA与miRNA进行整合分析,结果发现了17个miRNA所预测的靶基因占据了mRNA高通量测序结果的87%。随后我们利用DAVID对差异表达miRNA调控的表达上调和上调的重复性靶基因进行GO和Pathway分析。GO分析结果显示,受miRNA的所有表达差异显著性的基因中,只有7个有GO分类,并且都属于GO分类中的cellular component,即Cytoplasm和Cytoplasmic part。Pathway分析结果显示,受miRNAs调控的114个靶基因中,有28个属于45个pathway分类。进一步分析发现,这些差异表达的miRNA所预测的靶基因只有一个也在mRNA测序结果中具有显著性差异表达——miR-210 和 ATP11a。4,荧光定量PCR对高通量测序结果的验证通过荧光定量PCR方法对随机选择的ATP 11 A, TRDN, IFI27, MYL3, RPS4Y1, USP9Y, AMH, SLC28A2和miR-192, miR-133a, miR-210, miR-200c, miR-194, miR-891a进行了验证。结果显示各niRNA和mRNA的表达趋势与高通量测序结果一致。5,miR及其靶基因在胆囊上皮细胞中的调控双荧光素酶报告基因实验验证了miR-210及其靶基因ATPlla的关系,胆囊上皮细胞中过表达miR-210后,ATP11a的表达量明显降低。结论：我们在10对样本中明确了17个差异表达的miRNA和525个差异表达的mRNA,他们多富集于在细胞粘附、发育、凋亡等方面,与离子转运、胰岛素相关通路、免疫系统通路等有关联性。二者联合分析发现了17个差异表达的miRNA以及114个共表达的mRNA。最终确定了同为显著性差异表达的miR-210和它的靶基因ATP11a。