论文部分内容阅读
禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的传染性疾病综合症。低致病力禽流感常引起呼吸道症状，产蛋量下降。高致病性禽流感，一旦暴发，将会给中国乃至世界很多国家养禽业造成相当严重的经济损失。同H5亚型禽流感相比，H7亚型禽流感的暴发同样会给养禽业造成巨大的损失。H7亚型禽流感病毒不仅能侵袭鸡鸭等家禽，还能使笼养宠物鸟致病(如H7N1型)，甚至能感染人类。AIV基因组为8节段负链RNA，共编码10种与病毒结构和功能相关的蛋白质，其中血凝素(Hemagglutinin，HA)是AIV囊膜纤突的主要成分之一，血凝素(HA)是流感病毒的主要表面糖蛋白，HA具有产生中和抗体的能力，可产生免疫保护作用，因此血凝素在禽流感的诊断和防制中起重要作用。本研究以试验室保存的pMD18-T-H7-HA阳性质粒为模板，去除HA编码信号肽的核苷酸部分，应用生物学软件Primer5.0和Oligo4.0，分别设计HA和HA1两对引物，扩增出HA和HA1基因。并分别将其克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A的SacⅠ和KpnⅠ之间的多克隆位点上，命名为pBlueBacHis-H7-HA和pBlueBacHis-H7-HA1。纯化重组质粒并与杆状病毒共转染Sf9昆虫细胞，5d后获得重组病毒，命名为P1。将经过3轮蚀斑筛选纯化的重组病毒接种Sf9细胞大量繁殖后收获，PCR鉴定结果为完全纯化的病毒命名为P2。接种P2于Sf9单层细胞上，4d后收获病变细胞，经SDS-PAGE电泳鉴定，表达产物HA、HA1融合蛋白分子量约为66ku和42ku，与理论值相符。表达产物的Westernblotting和Dot-ELISA结果表明其可与鸡抗H7亚型血清发生特异性抗原反应，而与H5和H9亚型鸡抗血清间无交叉反应。血凝试验和间接免疫荧光试验证明了重组HA、HA1蛋白具有良好的生物学活性。本试验利用昆虫-杆状病毒表达系统表达的重组H7亚型HA、HA1蛋白为可溶性的，带有6个组氨酸标签，较易纯化。重组HA、HA1蛋白具有良好的抗原性。因此，杆状病毒高效表达的重组HA、HA1蛋白在H7亚型禽流感病毒诊断及新型亚单位疫苗研究方面具有发展前景。