论文部分内容阅读
目的:癫痫是一种常见的慢性发作性脑功能障碍综合症,其除癫痫发作外,常伴有认知功能不同程度的受损。临床上,癫痫伴有认知功能障碍的发生率约为30%～40%,癫痫患者认知功能的损害主要表现为注意力分散、学习记忆力减退、词汇表达能力下降、数字推理能力受损、情感行为异常以及社会适应能力下降等,这已成为影响癫痫患者生活质量的一个重要因素。因此,癫痫后认知功能的损害已被人们广泛重视,并且改善癫痫患者的认知功能已成为临床上癫痫治疗的又一严峻要求。本研究采用戊四氮点燃的慢性癫痫大鼠模型作为研究对象,以NMDA受体拮抗剂盐酸美金刚作为干预剂,应用Morris水迷宫检测大鼠认知功能的变化,应用免疫组化以及RT-PCR的方法对NMDA2A/2B的表达情况进行测定及分析,从分子水平对盐酸美金刚的作用机制进行初步探讨。旨在找到NMDA受体在大鼠癫痫后认知功能障碍中的作用以及美金刚对大鼠癫痫后认知功能障碍的干预作用,以期为临床治疗提供指导及理论依据。方法:清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD),体重约200±20g,,经两次Y-迷宫筛选合格后获得115只大鼠,随机分为对照组(n=20),PTZ组(n=25),PTZ+低剂量美金刚组(n=25),PTZ+中剂量美金刚组(n=25) PTZ+高剂量美金刚组(n=25)。PTZ组:按每公斤体重分别给予PTZ 35mg腹腔注射。连续注射44天,自给药第31天起,每日注射PTZ前30 min腹腔注射生理盐水3.5 ml/kg,共注射14天。每次注射后观察1小时,记录大鼠的行为表现,按照Racine六级评价标准,连续三次Ⅳ级以上发作,即达到点燃标准。各剂量美金刚组:前30天同PTZ组,从第31天起,完全点燃成功的大鼠每次注射PTZ前30 min分别给予5mg/kg,10mg/kg, 15mg /kg的美金刚腹腔注射。对照组:每腹腔注射生理盐水3.5 ml/kg,连续注射44天。应用morris水迷宫检测模型成功大鼠的认知功能,对大鼠海马区脑组织进行免疫组化染色,观察NMDA受体的分布情况,应用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)法检测大鼠海马区NMDA受体NR2A/2BmRNA水平的表达。结果:1动物模型情况:正常对照组均未观察到癫痫发作的表现。其余各组大鼠在注射PTZ后第3～7天起开始出现不同程度的凝视、点头、反复洗脸动作、面部及头部抽搐等,以后发作症状逐日加重,于给药第18～24天出现全身肌阵挛、双前肢抬起,最终发生全身强直-阵挛性发作,达到RacineⅣ～Ⅴ级的点燃标准,每次强直-阵挛发作持续数分钟不等。大鼠连续三次RacineⅣ～Ⅴ级发作后被认为点燃成功,PTZ组共有大鼠16只完全点燃,PTZ+MMT各组共制备模型52只。给予美金刚干预的大鼠癫痫发作的程度及发作持续时间上无明显变化。2 Morris水迷宫行为学检测结果:给予美金刚干预的大鼠与癫痫组大鼠比较,癫痫发作频率及强度无明显变化。水迷宫检测结果显示:癫痫组大鼠寻找平台的时间(即逃避潜伏期)比正常组大鼠明显延长(P<0.05)低剂量美金刚干预组大鼠寻找平台时间与癫痫组大鼠比较缩短,但无统计学意义(P>0.05),中高剂量美金刚干预组大鼠寻找平台时间比癫痫组大鼠明显缩短,有统计学意义(P<0.05),但两剂量组之间无明显差异(P>0.05)。说明盐酸美金刚对癫痫后大鼠的空间学习记忆能力具有改善作用。3 NMDAR2A/2B的表达:NMDAR2A/2BmRNA表达水平以NMDAR 2A/ 2B/β-actin mRNA值表示NMDAR2A/β-actin mRNA的值,戊四氮、正常组、5mg美金刚干预组、10mg美金刚干预组、15mg美金刚干预组分别为:0.12±0.03、0.59±0.07、0.26±0.09、0.29±0.09、0.62±0.08。NNDAR2B/β-actin mRNA值的,戊四氮、正常组、5mg美金刚干预组、10mg美金刚干预组、15mg美金刚干预组分别为:0.06±0.02、0.34±0.06、0.17±0.05、0.23±0.05、0.4±0.06。癫痫发作后海马部位NMDAR2A和NMDAR2B水平的表达较正常组明显下降(P<0.05),而给予美金刚干预后的癫痫组大鼠海马部位NR2A/2BmRNA水平的表达较癫痫组明显升高(P<0.05),在给予美金刚干预的各剂量组中,随着剂量的增加NR2A/2BmRNR水平的表达升高。说明在慢性戊四氮致癫痫大鼠模型中,美金刚可能增加大鼠海马区NR2A/2BmRNA水平的表达。4各组大鼠海马CA1区高倍镜下阳性细胞数为:NMDA2A表达显示:戊四氮组8.33±2.52个,5mg美金刚干预组11.33±1.53个,10mg美金刚干预组23.67±5.68个,15mg美金刚干预组28.33±1.53个,正常组17.67±3.06个;NMDA2B表达显示:戊四氮组13.67±3.06,5mg美金刚干预组15.67±2.08,10mg美金刚干预组30.33±5.51,15mg美金刚干预组35±3.61,正常组23±3.61;结果说明戊四氮致癫痫大鼠NMDA2A、NMDA2B蛋白在海马区的表达明显下降(P<0.05);给与中高剂量美金刚干预后NMDA2A、NMDA2B蛋白在海马区的表达与癫痫组比增高(P<0.05)。结论:1给与美金刚干预后的大鼠较戊四氮组大鼠认知功能有所改善。2戊四氮组大鼠NMDAR2A、NMDAR2B的表达水平较正常组下调,提示其可能参与癫痫的发病机制。3美金刚干预组大鼠NMDAR2A、NMDAR2B的表达水平较戊四氮组上调,提示美金刚可能通过调节NMDA受体的表达水平来改善癫痫后大鼠的认知功能损害。