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背景与目的:三阴型乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）是一种具有高度侵袭性和异质性的恶性肿瘤,在时间上或方法上采取不当的干预都可能导致不良的预后。细胞周期是细胞复制和发挥功能必不可少的复杂序列事件,其畸变已被认为是癌症发生的标志之一。目前周期素依赖性蛋白激酶（cyclin dependent kinase,CDK）4/6抑制剂palbociclib（PD）结合内分泌治疗已被证实是对激素受体（hormone receptor,HR）阳性/人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）阴性（HR+/HER2-）晚期或转移性乳腺癌的有效治疗方式。但对于其在TNBC中与化疗药物的联用研究较少,目前多通过增加药物配伍数量来增强抗肿瘤效应,对不同药物药理间的相互作用以及不同用药时间或顺序对疗效的影响方面不甚明了。本研究旨在探索PD能否增强顺铂（cisplatin,CDDP）对TNBC的抗肿瘤效应及其联用的最佳方案和相应分子机制。第一部分CDK4/6通路关键基因在TNBC中的变化情况目的:检测CDK4/6-cyclin D1-RB-E2F信号通路中关键基因在TNBC病人中的变化情况。方法:筛选TCGA数据库中TNBC病人的DNA拷贝数数据,利用c Bio Portal在线工具可视化CDK4/6-cyclin D1-RB-E2F信号通路中关键基因的变化情况。结果:从TCGA数据库中共筛选出171例TNBC病人的DNA拷贝数数据,通过可视化工具观察到15%的TNBC病人表现为周期素依赖性蛋白激酶抑制剂2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A,CDKN2A）扩增或删失,其中删失比较多见,占72%。CCND1、CDK4、CDK6和E2F1等与细胞周期调控相关的基因表现出1%～5%的扩增改变。23%的TNBC病人表现为视网膜母细胞瘤基因（retinoblastoma,RB）扩增、删失或其他突变,其中扩增占10.8%。结论:CDK4/6-cyclin D1-RB-E2F信号通路中部分基因的改变在TNBC中较常见,上述基因的突变和失调与CDK4/6通路的紊乱和细胞周期的失控相关。由此推测CDK4/6抑制剂可能对部分TNBC病人有效。第二部分初步建立三种PD与CDDP联用方案目的:探讨PD与CDDP三种常规联用方案的抗肿瘤效应。方法:1.利用q RT-PCR技术检测实验室现有乳腺癌细胞系RB基因的m RNA表达情况;2.利用流式细胞仪检测单用PD对细胞周期和凋亡的影响;3.利用流式细胞仪检测PD与CDDP三种常规联用方案对细胞凋亡的影响。结果:1.HR阳性乳腺癌细胞系的RB表达水平均较高。在TNBC细胞系中,仅MDA-MB-231细胞的RB表达水平较高,而MDA-MB-468细胞表达较低;2.在MDA-MB-231细胞中,PD单独作用24h可将细胞明显阻滞于G1期,但对凋亡无明显影响。在MDA-MB-468细胞中,PD对其周期和凋亡均无明显影响;3.因PD单用对TNBC细胞均无明显抗肿瘤效应,故探索PD与CDDP的联用效果。设计三种常见的联合用药方案:1、PD与CDDP共作用24h;2、PD作用24h续贯CDDP作用24h;3、CDDP作用24h续贯PD作用24h。结果显示无论上述哪种联用方案与单用CDDP对照组相比对MDA-MB-231细胞凋亡的影响均无明显差异。结论:PD对MDA-MB-231细胞有周期阻滞作用,但对MDA-MB-468细胞无此效应。PD与CDDP三种常见的联合用药方式分别与单用CDDP相比对MDA-MB-231细胞凋亡的影响无明显差异。第三部分根据PD对细胞周期的影响,建立三种新的PD与CDDP联用方案目的:探讨并建立PD与CDDP联合作用的新方案。方法:改变PD对MDA-MB-231细胞的作用时间,利用流式细胞仪检测其对细胞周期的精细调控情况,并根据结果建立与CDDP联用的新方案。结果:在MDA-MB-231细胞中,随着PD作用时间的延长,阻滞在G1期的细胞比例逐渐升高,在PD连续作用48h时达到高峰,继续延长PD作用时间,G1期细胞比例无明显增加,从而确定PD最佳连用时间是48h。而后进行撤药分析,在撤药48h时发现阻滞在G1期的细胞比例开始下降,部分细胞进入S期。由此建立了三种PD与CDDP联合应用的新方案:1、PD连续作用48h,其中第一个24h与CDDP共同作用（PD+CDDP）;2、PD作用48h,再撤药48h续贯CDDP作用24h（PD-CDDP）;3、CDDP作用24h,再撤药48h续贯PD作用48h（CDDP-PD）。结论:根据PD对细胞周期的影响重新设计了三种与CDDP联用方案:PD+CDDP、PD-CDDP、CDDP-PD。第四部分三种新联用方案对MDA-MB-231细胞增殖、DNA损伤及CDDP敏感性的影响目的:探讨新方案对MDA-MB-231细胞的影响并确立最佳联用方案。方法:1.利用流式细胞仪检测三种新用药方案对细胞凋亡的影响;2.利用免疫荧光技术检测三种新用药方案对细胞DNA损伤的影响;3.利用CCK-8法和克隆形成实验检测三种新用药方案对细胞增殖的影响;4.利用Graph Pad Prism软件和Chou-Talalay法计算三种新用药方案中CDDP的半数抑制浓度（the 50%inhibitory concentration,IC50）和两药联合指数（combination index,CI）;5.利用裸鼠建立TNBC肿瘤模型,按照最佳联用方案给药,定期测量移植瘤体积和重量,描述生长变化;利用免疫组化技术检测移植瘤Ki-67的表达情况。结果:1.相比其他新用药方案,PD-CDDP方案与单用CDDP相比能显著增加MDA-MB-231细胞的凋亡;2.PD-CDDP方案与单用CDDP相比能显著增加MDA-MB-231细胞的DNA损伤,具体表现为γH2AX阳性率增加;3.PD-CDDP方案与单用CDDP相比能显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖能力;4.在MDA-MB-231细胞中,PD-CDDP方案下CDDP的IC50是35.33μmol/L,显著低于对照组单用CDDP的IC50（57.09μmol/L）,差异有统计学意义。而在其他新方案中PD不能明显增强细胞对CDDP的敏感性;5.计算不同联用方案的CI指数,发现PD-CDDP方案的CI1,表明是拮抗效应;PD+CDDP方案的CI=1,表明是相加效应;6.利用裸鼠建立MDA-MB-231细胞移植瘤模型,按照PD-CDDP方案给药,发现移植瘤的体积和重量相比对照组均明显下降,并且Ki-67的表达也显著降低,进一步证明PD-CDDP方案在体内的抗肿瘤效应比单用CDDP显著。结论:在建立的三种新用药方案中,PD-CDDP方案与单用CDDP对照组相比在MDA-MB-231细胞的体内和体外实验中均表现出更明显的抗肿瘤效应。第五部分RB表达水平、CDK4/6信号通路与PD-CDDP方案疗效的相关性目的:探讨PD-CDDP方案的作用机制。方法:1.利用慢病毒转染技术,将sh RB及其对照质粒转入MDA-MB-231细胞中,过表达质粒及其对照质粒转入MDA-MB-468细胞中,构建稳定转染的细胞系。利用q RT-PCR和Western blot（WB）技术分别检测RB m RNA和蛋白的表达情况以明确转染效果;2.利用sh-MDA-MB-231细胞按PD-CDDP用药方案重复第四部分的体外实验;3.利用Vector/OE-MDA-MB-468细胞按PD-CDDP用药方案重复第四部分的体外实验;4.收集经PD-CDDP方案处理的NC-MDA-MB-231和sh-MDA-MB-231细胞,利用WB技术检测其CDK4/6-cyclin D1-RB-E2F信号通路中关键蛋白的表达情况,并从蛋白水平再次验证该方案对细胞凋亡和DNA损伤的影响。结果:1.sh-MDA-MB-231细胞经PD-CDDP方案处理后,细胞周期、凋亡、DNA损伤及增殖能力与单用CDDP相比均无明显差异;2.OE-MDA-MB-468细胞经PD-CDDP方案处理后与单用CDDP相比,细胞明显阻滞在G1期,细胞凋亡及DNA损伤明显增加,细胞增殖能力也显著降低;3.在NC-MDA-MB-231细胞中,PD-CDDP实验组与CDDP对照组相比,p-RB蛋白的表达水平明显降低,下游E2F1转录因子也显著降低。而在sh-MDA-MB-231细胞中,没有观察到上述变化;4.在NC-MDA-MB-231细胞中,经PD-CDDP方案处理后其cleaved PARP和γH2AX的表达相比对照组显著增加,而在sh-MDA-MB-231细胞中无此表现。结论:PD以RB依赖的方式增加TNBC细胞对CDDP的敏感性,PD-CDDP方案仅在RB高表达的TNBC细胞中具有比单用CDDP更明显的抗肿瘤效应,并通过CDK4/6-cyclin D1-RB-E2F信号通路发挥作用。