论文部分内容阅读
第一部分单细胞测序确定人主动脉瓣膜细胞组分目的:获取人主动脉组织并分离组织细胞进行单细胞测序以鉴定组织中细胞类型。方法:经华中科技大学同济医学院伦理委员会批准,收取临床诊断为非瓣膜疾病需行心脏移植手术患者受体心脏主动脉瓣膜及诊断为CAVD需行主动脉瓣置换手术患者病变主动脉瓣膜。经超声、手术医师及病理检测联合诊断后,将组织样本分为对照低龄组、对照高龄组以及钙化病变组。组织样本经过物理剪碎和消化酶分散制备单细胞悬液,在获得样本6小时内完成送样到细胞转录组信息收集过程。数据随后进行UMAP聚类和细胞分型分析,并在主动脉瓣膜组织及原代细胞进行验证实验。结果:9例主动脉瓣膜组织中共获得94,277个细胞,鉴定出11群细胞亚群,分别以CD68、CCL3L1为标记基因鉴定出瓣膜巨噬细胞cluster 6;以CD3D、CD3E为标记基因鉴定出瓣膜淋巴细胞cluster 9;以ECSCR、TEK为标记基因鉴定出瓣膜内皮细胞cluster 8。瓣膜间质细胞中以LUM、MFAP4为cluster 0标记物;FOS、PTN为cluster 2标记物;SPARC、COL1A2为cluster 3标记物;C7为cluster 4标记物;SPOCK3为cluster 7标记物;MT1A、CDH19为cluster 10标记物。鉴定出钙化病变主体细胞cluster 1和cluster 5,分别以CCL20、RPL17、CMSS1、AKR1C1、S100A11为标记基因。在对照高龄组中,cluster 0细胞比例明显增加至34.5%。钙化病变组中cluster 1和cluster 5比例为47%和30%。结论:主动脉瓣膜组织中有11群细胞分别为瓣膜淋巴细胞、瓣膜巨噬细胞和瓣膜内皮细胞和瓣膜间质细胞群。瓣膜间质细胞群分为8群即cluster 0、cluster 2、cluster3、cluster 4、cluster 7、cluster 10、cluster 1、cluster 5。病变主动脉瓣膜组织中间质细胞以cluster 1和cluster 5为主。对照高龄组主动脉瓣膜组织间质细胞cluster 0比例明显增加,可能是发生CAVD病变的关键细胞。第二部分基于单细胞测序分析揭示炎症反应为CAVD发生的关键始动因素目的:分析主动脉瓣膜间质细胞亚群特性,解析不同病理生理状态下主动脉瓣膜细胞转录信息,从单细胞水平展示主动脉瓣膜病理生理变化,探讨CAVD发生的关键致病机制。方法:针对高通量单细胞测序数据进行合理有序的筛选后进行GO功能注释和KEGG信号通路富集,并对细胞群进行PAGA分化轨迹分析及Monocle拟时序分析细胞群内在联系,最后在组织水平进行验证,并尝试分离原代细胞进行体外验证。结果:研究显示瓣膜间质细胞亚群具有普遍的细胞外基质重塑功能,分群中cluster0以骨形成为显著,cluster 2以Wnt信号通路作用突出,cluster 3突出成软骨分化作用,cluster 4突出成胶质细胞分化,cluster 7突出成肌细胞分化,cluster 10具备多向分化潜力。钙化病变主体细胞中cluster 1是多条信号通路异常激活后分化结果,cluster5则有显著的代谢相关信号通路和自噬调控的特点。各细胞亚群基因变化分析显示免疫细胞释放炎症因子及促进主动脉瓣膜炎症反应发生,瓣膜内皮细胞则向间质细胞转化促进炎症调节与间质重构。Cluster 0比例上调促进TNF信号通路激活以及细胞外基质重塑。本次研究在组织学水平验证了瓣膜内皮细胞向间质分化的现象,并分离提取瓣膜内皮细胞进行体外实验验证内皮向间质转化特性。结论:随着年龄的增加,瓣膜组织中瓣膜免疫细胞及瓣膜内皮细胞功能减退,同时促进主动脉瓣膜内炎症因子释放,激活炎症反应发。此外瓣膜内皮细胞向间质细胞亚群转化使得主动脉瓣膜内皮层保护作用消失,进而加速主动脉瓣膜病变发生。瓣膜间质细胞群亚群普遍具有细胞外基质重塑功能,但又有各自特有的表型特征。其中,cluster 0具有明显骨形成能力。且Cluster 0细胞亚群比例增加促进主动脉瓣膜间质中TNF信号通路激活和细胞外基质重塑。钙化病变主体细胞分为炎症信号通路异常激活和代谢相关信号通路异常激活两种类型。第三部分穿心莲内酯抑制炎症反应延缓CAVD机制研究目的:探究小分子化合物穿心莲内酯（Andrographolide,AGP）在体外抑制瓣膜间质细胞成骨分化的作用及其具体分子机制。方法:成骨诱导培养基培养瓣膜间质细胞（VIC）构建体外瓣膜钙化模型,同时对瓣膜间质细胞给予AGP干预。茜素红染色检测细胞中钙结节形成情况,并且基因检测和蛋白质检测成骨关键分子表达情况。利用转录组测序数据分析AGP主要作用信号通路,最后进一步对富集的信号通路进行实验验证。结果:体外细胞模型中,AGP明显抑制瓣膜间质细胞钙结节形成,PCR、Western Bloting、免疫荧光检测均显示AGP抑制成骨关键蛋白RUNX2、ALP表达。进一步转录组测序分析显示AGP抑制成骨诱导过程中TNF、PI3K-AKT及ERK信号通路,蛋白检测发现关键蛋白ERK,IκBα和AKT的磷酸化过程受抑制,信号通路激活受阻而抑制瓣膜间质细胞成骨分化。结论:穿心莲内酯可能通过抑制ERK,IκBα和AKT分子的磷酸化而调控PI3KAKT,ERK1/2,NF-kappa B,TNF等信号通路抑制瓣膜间质细胞成骨样分化。