中药注射剂因起效快、生物利用度高等特点,目前在临床危重急救、心脑血管等疾病、恶性肿瘤的治疗中被广泛应用。然而,近年来有关中药不良反应的报道逐渐增多,尤其是严重的不良反应事件,如鱼腥草、双黄连、清开灵注射液引起的过敏性休克等,严重地制约了我国中医药事业的发展。中药注射剂的不良反应主要是过敏反应和类过敏反应。但是,目前国内外药物免疫毒性评价指导原则仅仅局限于动物模型的评价,并且只针对免疫抑制和接触性过敏进行评价,不涵盖药物诱导的系统性过敏和自身免疫疾病。现有报道的中药注射剂引发的过敏性休克等,在临床前药物安全性评价中多为阴性。由此看来,现有的平价方法可能不够敏感,或是实验动物与人类的免疫系统存在较大的差异致使动物实验无法预测免疫毒性。如何在临床前安全性评价中预测过敏反应等免疫毒性是科学家面临的巨大挑战。1.研究目的非人灵长类动物因为其生理学与生物进化等方面与人类最为接近,所以成为目前生物技术药物临床前安全性评价中最常用的动物模型之一。但是,2006年英国Ⅰ期临床实验中健康自愿者接受TGN1412单抗(CD28单抗超级激活剂)后出现多器官功能的衰竭,而临床前食蟹猴的毒性研究中未发现任何异常。此外,中药注射剂临床前研究中致敏实验多呈阴性,进入市场后却出现较多的过敏反应甚至休克或死亡等不良反应。本中心前期的研究也发现中药注射剂辅料吐温80在不同种属动物中诱导的类过敏反应程度差异很大,这均显示了动物种属间免疫系统对于外源性过敏物质产生免疫应答的不同。因此,深入研究不同动物免疫系统的异同,尤其是动物与人免疫系统的差异性是药物免疫毒性评价的关键技术之一,这将有助于临床前安全性评价中动物种属的选择,动物毒性数据的外推和准确客观地评估药物对人类健康的影响。免疫毒理学体外试验逐渐受到人们的重视,一方面体外试验可以减少动物的使用,一方面体外试验可以采用人外周血进行药物免疫毒性研究,有助于平行比较人和动物免疫功能的差异。此外,毒理基因组微阵列在解决毒理学动物实验结果外推到人类的问题上发挥了巨大的优势。药物在不同生物体内的药代动力学即药物在体内的分布和代谢情况等,是不同物种间实验数据互推的重要依据,而关键基因的变化可以成为药物代谢的终点。因此,比较动物与人类组织细胞中毒性相关基因微阵列表达谱的差异,寻找人和动物均表达的关键基因序列,可以科学地、准确地将动物毒性实验数据外推到人类。本研究以实验室已有的研究成果为基础,利用免疫组织化学方法,探讨不同种属(人、食蟹猴、恒河猴)淋巴结和胸腺中不同类型免疫细胞分布及数量上的差异；结合多种免疫细胞功能试验,探讨人和食蟹猴外周血单核细胞免疫功能的差异,为临床前药物免疫毒性评价建立起合适的体外试验方法,并且为生物技术药物及中药注射剂安全性评价选择动物种属及动物毒性研究外推之人的风险评估提供科学支持；利用基因组信息技术,研究人和食蟹猴外周血单核细胞在T/B细胞激活剂作用下基因转录表达谱的变化,从基因水平分析人和食蟹猴免疫激活反应机制的异同,以寻找可能存在的桥接生物标志物。2.研究方法2.1人和食蟹猴、恒河猴的淋巴结、胸腺中不同类型免疫细胞表型及数量的差异性研究收集中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心2004至2011年共31项食蟹猴/恒河猴毒性研究试验中阴性对照组动物(恒河猴76只、食蟹猴104只)的淋巴结和胸腺,以及正常成人组织交叉反应标本库正常人体淋巴结和胸腺(淋巴结11例、胸腺4例)。所有组织进行免疫组织化学检测,平行比较不同类型淋巴细胞的分布及数量特点,包括B淋巴细胞(CD20)、T淋巴细胞(CD3、 CD4、 CD8)以及巨噬细胞(CD68)。2.2人和食蟹猴T细胞和B细胞功能的比较性研究(1)单抗诱导细胞因子释放试验：收集食蟹猴和正常健康人外周血单形核细胞(PBMC)。实验分为2个实验组,包括阴性对照组(同型对照单抗IgG)和ANC28.1单抗组。PBMC细胞给予相应的刺激剂及阴性对照物后,37℃温箱孵育。每个实验组在2小时、24小时和48小时收集相应的细胞培养液。采用了Lucy Findlay建立的风干包被法及湿包法,进行TNF-α、 IFN-γ的ELSIA检测。(2)T细胞增殖实验及B细胞增殖实验：收集食蟹猴和正常健康人外周血PBMC细胞。T细胞增殖实验中,实验分为4个实验组,包括阴性对照组(细胞培养液)、PHA组(2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)。同样,B细胞增殖实验中实验分为4个实验组,包括阴性对照组(细胞培养液)、LPS组(2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)。37℃温箱孵育,孵育72小时后,加入10μl的CCK-8(细胞计数试剂盒,Dojindo公司),进行细胞增殖检测。(3)B细胞抗体形成功能测定实验：实验一采用食蟹猴的外周血,分离收集PBMC细胞,分为6个实验组,包括阴性对照组1(细胞培养液,包被浓度为1：30)、阴性对照组2(细胞培养液,包被浓度1：90)、流感疫苗刺激组1(刺激浓度为1：50,包被浓度1：30)、流感疫苗刺激组2(刺激浓度为1：50,包被浓度1：90)、流感疫苗抑制组1(抗CD20单克隆抗体+流感疫苗,包被浓度1：30)、流感疫苗抑制组2(抗CD20单克隆抗体+流感疫苗,包被浓度1：90)。实验二采用正常健康人外周血,分离收集PBMC细胞,分为8个实验组,包括阴性对照组1(细胞培养液,包被浓度1：30)、阴性对照组2(细胞培养液,包被浓度1：90)、流感疫苗低剂量组1(刺激浓度为1：50,包被浓度1：30)、流感疫苗低剂量组2(刺激浓度为1：50,包被浓度1：90)、流感疫苗高剂量组1(刺激浓度为1：10,包被浓度1：30)、流感疫苗高剂量组2(刺激浓度为1：10,包被浓度1：90)、流感疫苗抑制组1(抗CD20单克隆抗体+流感疫苗,包被浓度1：30)、流感疫苗抑制组2(抗CD20单克隆抗体+流感疫苗,包被浓度1：90)。每组给予相应的刺激剂、阴性对照物及抑制剂(抗CD20单克隆抗体),37℃温箱孵育。孵育6天后,进行ELISPOT检测抗体的分泌。2.3T细胞激活剂及B细胞激活剂诱导的人和食蟹猴外周血单核细胞的基因表达谱的研究实验采用人和食蟹猴的外周血PBMC细胞。实验分为5个实验组：阴性对照组(PBS)、2μg/ml PHA组、10μg/ml PHA组、2μg/ml LPS组、10μg/ml LPS组。每组给予相应的刺激剂及阴性对照物,37℃温箱连续孵育3天后,分别提取各组细胞的总RNA,进行基因芯片分析。通过设定基因表达变化倍数绝对值大于等于2,且p<0.05选出差异表达基因。比较人和食蟹猴外周血PBMC细胞在T细胞激活剂和B细胞激活剂后的出现的差异表达基因(DEGs, Differentially Expressed Genes)。通过GO功能注释富集度分析和KEGG通路分析差异表达基因的特征。3.研究结果3.1人和食蟹猴、恒河猴的淋巴结、胸腺中T细胞、B细胞及巨噬细胞分布和数量特点B淋巴细胞主要位于淋巴结的皮质淋巴滤泡和胸腺的髓质。抗人CD20单抗能与食蟹猴／恒河猴组织结合,呈强阳性,显示人猴之间B细胞存在高度的遗传相关性。T淋巴细胞主要位于淋巴结的副皮质区及胸腺的皮质和髓质。抗人CD3单抗能与食蟹猴／恒河猴组织结合,但为阳性或中度阳性。抗人CD4单抗与食蟹猴／恒河猴存在较弱的交叉反应,抗人CD8单抗与食蟹猴／恒河猴无交叉反应。人、食蟹猴和恒河猴胸腺中T细胞含量无统计学差异。但是有趣的是,人淋巴结中T细胞／B细胞的比例与食蟹猴和恒河猴非常接近。巨噬细胞主要分布于淋巴结髓质、胸腺的皮质和髓质。抗人CD68单抗能与食蟹猴／恒河猴组织结合,呈强阳性。食蟹猴／恒河猴淋巴结和胸腺中该细胞无论从分布还是细胞染色强度均与人类非常相似。3.2人和食蟹猴T细胞和B细胞增值率、细胞因子及抗体分泌的差异(1)单抗诱导细胞因子释放试验ANC28.1作为CD28单抗超级激活剂,无须CD3单抗共同刺激,单独即可诱导激活人外周血中PBMC细胞。随ANC28.1作用时间的延长,人PBMC细胞释放的TNF-α及INF-γ逐渐增加。干包法和湿包法本身对于ANC28.1诱导人PBMC释放细胞因子无明显差异。ANC28.1单抗不能诱导食蟹猴外周血PBMC细胞释放TNF-α和IFN-γ。(2)T细胞/B细胞增殖实验人和食蟹猴外周血PBMC细胞随着给予T细胞激活剂植物血凝素(PHA)浓度的增加,其细胞数目明显增加。但是,在同样浓度PHA刺激下,人外周血PBMC细胞的增长幅度明显高于食蟹猴PBMC细胞的增殖。人和食蟹猴外周血PBMC细胞随着给予B细胞激活剂脂多糖(LPS)浓度的增加,其细胞数目明显增加。在不同浓度LPS刺激下,食蟹猴与人外周血中PBMC增殖趋势非常相似。(3)B细胞抗体形成功能测定实验：食蟹猴和人外周血PBMC细胞给予流感疫苗刺激后,其分泌相应抗体的细胞斑点数目明显高于阴性对照组。给予抗CD20单抗后,食蟹猴抑制组流感疫苗诱导的分泌抗体的细胞斑点数目明显降低。相同处理条件下流感疫苗包被浓度1：90组所产生的细胞斑点数目略高于包被浓度1：30组。比较人和食蟹猴外周血PBMC细胞在相同处理条件下,分泌流感疫苗抗体的细胞数目增长幅度类似,两者无显著性差异。3.3T细胞激活剂及B细胞激活剂诱导的人和食蟹猴外周血单核细胞的基因表达谱的差异人外周血PBMC细胞给予PHA后,低剂量组和高剂量组分别发现差异表达基因115个和1510个。食蟹猴外周血PBMC细胞给予PHA后,低剂量组和高剂量分别发现差异表达基因21个和166个。人和食蟹猴对于PHA(T细胞非特异性激活剂)存在相同的免疫作用机制,如差异基因均参与了DNA复制、免疫应答、趋化作用及炎性应答。两种属间主要的不同点：1)人参与的基因数目众多,远远高于食蟹猴；2)人的细胞增殖反应非常强烈,尤其以有丝分裂或M分裂相为主的基因多,而食蟹猴的增殖较弱,仅仅以DNA的复制、细胞形态的调节和抗凋亡为主；3)人的免疫应答的相关基因以炎性细胞和免疫应答功能为主,值得注意的是与抗原处理呈递相关的也是以MHCⅡ类分子为主；正好相反,食蟹猴的免疫应答中以抗原处理呈递和免疫应答功能为主,其中涉及的抗原处理呈递以MHCⅠ类分子为主。人外周血PBMC细胞给予LPS后,低剂量组和高剂量组分别发现差异表达基因341个和810个。食蟹猴外周血PBMC细胞给予LPS后,低剂量组和高剂量分别发现差异表达基因588个和562个。人和食蟹猴对LPS(T细胞非特异性激活剂)存在相同的免疫作用机制,如差异基因均参与免疫应答、通过MHCⅡ分子的外源性肽或多糖的抗原处理呈递。此外,与PHA刺激不同,LPS刺激下人外周血PBMC细胞中的差异表达基因数目与食蟹猴无明显差异。主要的不同点：人外周血PBMC在LPS刺激下,差异表达基因主要参与免疫应答和炎性细胞应答,其次为MHCⅡ类分子的抗原呈递和T细胞共刺激。食蟹猴的差异基因主要参与的炎症应答是抗原处理呈递的,包括MHCⅠ和MHCⅡ类分子的抗原处理呈递。4.结论从形态上,食蟹猴/恒河猴胸腺及淋巴结中T淋巴细胞与人存在差异,尤其是细胞毒性T细胞。而食蟹猴/恒河猴与人B淋巴细胞和巨噬细胞无论细胞分布还是染色强度都比较一致,显示种属间的高度遗传相似性。尽管人淋巴结中T细胞和B细胞含量均高于食蟹猴,但T/B细胞比例非常接近,提示两种种属之间的相似性。从功能上,研究发现人外周血PBMC细胞在CD28超级激活剂诱导下能分泌大量的细胞因子TNF-α和IFN-γ,而食蟹猴外周血PBMC细胞未见细胞因子的分泌。给予非特异性T细胞激活剂PHA后,人外周血PBMC细胞增殖明显高于食蟹猴PBMC细胞的增殖。上述结果提示人外周血T淋巴细胞更敏感,更容易受到相应激活剂的激活。而人和食蟹猴外周血PBMC细胞给与B细胞激活剂LPS时表现出相似的增殖趋势。在B细胞抗体形成测定实验中,显示出食蟹猴外周血B细胞与人B细胞具有类似的产生抗体的能力。从基因水平,研究发现人和食蟹猴外周血PBMC细胞给予T细胞激活剂PHA后,人外周血差异表达基因数目远高于食蟹猴。这些差异基因的功能主要包括炎性细胞应答、免疫应答、以MHCⅡ类分子为主的抗原呈递、细胞周期及增殖等。人和食蟹猴外周血PBMC细胞给与B细胞激活剂LPS后,差异表达基因主要参与免疫应答、炎性细胞应答、抗原呈递处理、T细胞共刺激等。不同于PHA,人和食蟹猴所产生的差异基因数目相似。此外,尽管人和食蟹猴在基因表达谱的变化中存在一定的差异,但是两种属间仍存在具有相同功能的基因群,如免疫应答、炎性应答、DNA复制和趋化作用。总之,人和食蟹猴T细胞表型分子的同源性以及T细胞增殖及细胞因子分泌等功能存在明显差异。T细胞激活基因表达谱的研究,再次证实了人相对于食蟹猴而言,其基因参与的T细胞激活免疫应答涉及的基因调控网络更复杂,更敏感。该研究结果可能为临床前食蟹猴动物实验预测免疫毒性的敏感性低的原因提供了科学依据。这提示我们在将来从事药物的免疫毒性评价中,比如中药注射剂或者生物技术药物等的免疫激活评价时,对于动物数据中T细胞毒性的评价外推至人时需要慎重考虑,可能未来补充人外周血的体外试验是药物免疫毒性评价的方向。其次,食蟹猴B细胞表型分子的同源性以及B细胞增殖和抗体分泌等功能与人比较相似。B细胞激活的基因表达谱的研究显示人和食蟹猴的免疫应答基因的功能存在一定的相同。最后,综合T/B细胞激活的毒理基因组学研究,发现免疫应答、DNA复制、炎性应答功能相关的基因存在于两种种属的各个处理组中,这提示与这些共同的免疫应答功能相关的基因变化可能与免疫激活密切相关,该类基因群有望成为物种间免疫毒性数据转化的桥接生物标志物。