日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)的囊膜蛋白(Envelope protein,E)由500个氨基酸组成,共有3个抗原域(Domain),域Ⅰ、域Ⅱ、域Ⅲ。其中域Ⅲ能够独立的在病毒表面折叠成为免疫球蛋白样的结构,与受体的结合密切相关。研究表明,EDⅢ蛋白上含有乙脑病毒的中和抗原表位,可刺激动物机体产生中和抗体,EDⅢ蛋白可作为检测疫苗免疫后抗体水平的JEV抗原。本研究主要利用JEV EDⅢ蛋白,检测了三个厂家的乙型脑炎弱毒疫苗株免疫小鼠后血清中JEV抗体水平的变化情况。并探索了产生抗体水平差异的原因;利用实验室制备的具有中和活性的EDⅢ蛋白单克隆抗体(命名为1c4),鉴定出了一个JEV的线性表位,为今后乙型脑炎疫苗的安全、有效生产和新疫苗的研制提供参考依据。1.不同厂家的猪乙型脑炎弱毒疫苗对小鼠免疫应答的研究通过在乳仓鼠肾细胞(BHK-21)上对三个不同厂家的猪用商品化疫苗进行空斑形成实验,发现不同厂家的疫苗毒株能够在细胞上形成不同大小的空斑形态,在ICR小鼠模型上免疫这三个不同厂家的猪乙型脑炎商品化疫苗,并测定JEV杭体水平,发现空斑形态明显偏小的毒株,其免疫小鼠后会产生较高水平的抗体应答。对分别显示大、小空斑的疫苗毒株进行空斑纯化,得到纯化的JEV弱毒株,两个毒株的全基因组测序分析显示空斑形态偏小的毒株具有一个在1813位的核苷酸突变,即E蛋白279位由原来的蛋氨酸(M)突变为赖氨酸(K)。用纯化的弱毒株免疫ICR小鼠,测定血清中JEV抗体水平,ELISA结果显示呈现小斑的毒株免疫后能产生更高水平的JEV抗体。说明E279位发生氨基酸突变的弱毒株对小鼠免疫后会产生更高水平的免疫应答。这与先前商品化疫苗免疫小鼠后,不同厂家毒株诱使小鼠产生的抗体水平差异相对应。本研究探究了 E279位氨基酸突变对乙脑疫苗SA14-14-2在小鼠上免疫应答的影响,为疫苗的生产和评估提供参考。2.乙型脑炎病毒蛋白EDⅢ单克隆抗体的表位鉴定研究根据已发表的JEV EDⅢ蛋白基因序列设计引物,利用载体pGEX-6P-1构建原核质粒表达载体pGEX-6P-1-E1、pGEX-6P-1-E2,将EDⅢ蛋白在大肠杆菌R2中两段表达。通过Western Blot,单克隆抗体1c4特异性识别GST-E2融合蛋白。随后设计抗原小肽作为检测抗原,使用ELISA方法进一步缩小1c4能够识别的区域,同时,为精确线性表位的氨基酸序列,通过构建原核表达载体pGEX-6P-1-R1、pGEX-6P-1-R2、pGEX-6P-1-R3、pGEX-6P-1-R4、pGEX-6P-1-R5,在大肠杆菌 DH5α 中高效融合表达,利用单克隆抗体能够特异性识别单个表位的特性,使用Western Blot得到了线性表位的精确氨基酸序列。本研究利用单克隆抗体1c4,通过原核表达载体构建和抗原小肽的方法,得到了为乙脑病毒的一个线性表位375EPPFGDS381,为JEV生物学特征的进一步研究打下基础,同时为基因工程疫苗、免疫胶体金诊断等提供理论依据。