地黄（Rehmanniaglutinosa L.）是玄参科多年生草本植物,具有悠久的栽培及药用历史。然而在地黄的生产中存在着严重的连作障碍问题,每茬收获后须隔8年～10年后方可再种。前期的大量研究证实地黄根际化感物质的积累及诱导的微生态失衡可能是造成地黄连作障碍的主要原因。但是连作地黄的根际灾变环境仅危害其自身对其它下茬作物却没有危害效应,表明地黄体内存在着一套独特的信号系统来感知、响应连作毒害。因此,鉴定和勾勒连作地黄体内的独特的信号系统对阐述连作障碍的形成机制具有重要意义。信号转导的前提是对信号的接收,不同的研究已经证明位于细胞膜上的受体蛋白是植物感知外界环境信号的主要通道。因此,鉴定和筛选连作地黄的膜受体蛋白成为揭示连作障碍形成分子机制的必由之路。基于此,本研究整合分析已有的地黄转录组数据,构建出目前较为完整的转录组数据库和响应的蛋白序列集;筛选有效的地黄根组织膜蛋白的提取分离方法,并利用优化的膜蛋白提取方法结合iTRAQ技术筛选连作与头茬地黄根组织中的差异表达膜蛋白;通过差异膜蛋白质的生物功能分析阐述地黄对连作毒害的接收和响应机制。本研究的主要内容如下:1.地黄大容量蛋白文库的构建通过对课题组不同年度所构建Illumina测序所得到的转录组数据与公共数据库454测序得到的转录组数据进行整合分析,组建出了含有66,906条序列的大容量地黄转录组数据。最终拼接组装获得的序列容量高达58.7Mbp,N50的平均长度为868bp。转录组序列翻译结果产生了 47,818个序列,其对应的氨基酸序列长度分布在100～3,500氨基（aa）之间。蛋白质功能分析表明所获取地黄蛋白集所涉及的遗传信息涵盖了转录、翻译及修复,参与体内生物代谢通路,并与细胞信号的感知及转导等生物过程有关。地黄蛋白质序列集的整合和获取,为深入研究地黄连作障碍的形成机制奠定基础。2.地黄根组织膜蛋白提取方法的选择通过对连作和头茬地黄不同生育时期关键生理和形态指标的分析,本研究发现连作地黄种植后60天（Days after planting,DAPs）时开始表现出轻微连作伤害效应,但不是很明显,在栽种后90 DAPs时连作地黄开始出现明显的伤害表型,连作和头茬地黄在表型和生理响应均出现明显的差异。因此,本研究以连作栽种后90 DAPs的地黄根组织为对象,开展进一步研究获取连作伤害关键敏感期响应受体蛋白。为了选择和确定出适合地黄根组织膜蛋白提取的适宜方法,本研究采用膜蛋白离心管柱提取法、植物膜蛋白提取试剂盒化学提取法及Tris结合超高速离心法,分别提取地黄根组织的膜蛋白,并利用LC-MS/MS分析膜蛋白分离和富集效率。对比分析不同方法提取膜蛋白的浓度及提取膜蛋白效率发现:利用植物膜蛋白提取试剂盒能够从地黄根组织细胞中很好地提取出膜蛋白,获取蛋白中的膜蛋白含量占比达到61.15%。对所获取的根膜蛋白进行功能分析发现,所提取的膜蛋白位于多种细胞器的膜结构上,种类丰富。地黄根组织膜蛋白提取方法的建立,为进一步高效、准确地开展连作和头茬地黄根组织膜差异蛋白质组学研究提供了基本的手段。3.连作地黄根组织差异表达膜蛋白的鉴定及功能分析利用上述优化的植物膜蛋白提取法提取连作和头茬地黄膨大前期的根组织膜蛋白,利用iTRAQ技术鉴定连作和头茬地黄差异表达膜蛋白,各设3个生物学重复。基于P-value<0.05且表达量阈值为1.2对连作和头茬的膜蛋白进行差异筛选,结果在连作和头茬地黄的根中共鉴定得到912个差异表达蛋白质,其中,膜蛋白698个,占总差异表达蛋白的77%,提取效率能够完全反应出细胞的膜蛋白状态。差异表达膜蛋白的功能分析结果表明:连作和头茬地黄根差异膜蛋白广泛分布在质膜、内质网、线粒体等亚细胞器上,具有结合、转运、代谢、响应胁迫刺激等生物功能。多个水通道蛋白PIP、氯离子通道蛋白CLCN7、线粒体外膜孔道蛋白VDAC2和跨膜转运蛋白等在连作地黄中显著上调,同时,连作中上调表达的还有免疫响应相关蛋白、氧化还原蛋白、脂类代谢过程蛋白、植物与病原菌互作蛋白、Ca2+信号相关蛋白和植物甾醇代谢相关蛋白等。但响应胁迫及化学刺激、分解代谢、初级代谢过程的蛋白呈在连作地黄显著下调表达。通过对差异膜蛋白功能整合研究表明,化感自毒物质或由此诱发根际微生态失衡显著的刺激了连作地黄免疫响应体系,导致大量LRR-RLKs受体蛋白大幅上调。同时,地黄钙信号和相关受体信号响应和传递了连作胁迫信号,而这些胁迫效应综合作用诱使连作地黄根组织细胞膜发生了较为严重氧化胁迫响应,导致膜质过氧化,胞内信号发生紊乱,最终产生连作胁迫。4.连作毒害关键响应事件的鉴定和分析通过上述差异膜蛋白功能分析,初步可以勾勒出连作毒害过程中的一些关键性事件。为了对连作毒害的事件做进一步了解,本研究详细分析了 LRR-RLKs蛋白和钙信号相关蛋白在连作毒害中的作用方式。用qRT-PCR分析上述连作毒害的关键钙响应蛋白和钙运输体蛋白基因在连作和头茬地黄中的表达,结果发现在连作地黄中钙信号相关的受体均呈现出显著的上调表达。通过钙荧光染色的方法发现连作地黄根尖钙离子浓度显著高于头茬地黄。同时,利用qRT-PCR对LRR-RLKs受体蛋白编码基因在连作和头茬地黄中的表达,分析结果发现LRR-RLKs表达模式与连作毒害伤害症状基本一致。同时,用连作地黄根际分离的地黄专一致病菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.,FO）侵染地黄根部,发现FO能够极大幅度的刺激LRR-RLKs上调表达。以上的结果证明了连作毒害根际微生态灾变的分子证据,也侧面表明通过连作和头茬地黄差异膜蛋白所获得连作伤害响应分子事件的可靠性。5.响应连作效应的地黄差异膜蛋白的磷酸化分析膜蛋白本身的激活是保证其信号顺利下传的前提,而膜蛋白磷酸化是其活性开启的典型标志。为了深入研究地黄连作响应的膜蛋白的活性变化。本研究结合已经获取的地黄磷酸化肽段序列库,对本研究所鉴定到的膜蛋白进行磷酸化分析,结果发现67显著差异表达膜蛋白可以在连作和头茬地黄磷酸化蛋白库匹配到磷酸化肽段,包括17个上调的膜蛋白,50个下调膜蛋白。为了从一个更小范围内研究连作和头茬地黄之间膜蛋白功能,重新对潜在磷酸化膜蛋白进行功能分析,结果发现在头茬地黄中显著上调磷酸化蛋白大部分功能与细胞正常代谢进程密切相关,如参与细胞代谢、生物调节中的催化蛋白、刺激响应蛋白等,而这些进程在连作中的表达被抑制。因此,从磷酸化膜蛋白的功能分析也显示出连作地黄的正常生物功能被改变或缺失,最终导致地黄植株胁迫效应产生。在缺乏地黄基因组信息的现状下,本研究构建了地黄蛋白序列参考集,筛选了适合地黄根组织的膜蛋白提取方法,并以此为基础鉴定了连作和头茬地黄根组织中差异表达的膜蛋白质。差异表达膜蛋白的功能分析发现,在连作地黄的根组织细胞内发生一系列的胁迫响应,如:产生膜脂过氧化,致使细胞膜正常结构被破坏;植物免疫系统相关蛋白LRR-RLK受体蛋白激酶上调表达。同时,连作激活了地黄体内Ca2+信号相关系统,对连作根际的伤害信号进行传递。此外,胁迫因子诱导膜上离子通道蛋白,如水通道蛋白发生异常表达和内吞作用相关蛋白活跃表达,造成连作地黄正常的运输体系发生紊乱。本研究通过连作和头茬地黄根组织的膜蛋白质组学研究,鉴定出根组织膜上响应连作胁迫的特异受体蛋白,探讨了膜蛋白通过磷酸化修饰进行的信号转导情况,为完善地黄体内连作胁迫的信号传导通路及勾勒胁迫信号的感知系统提供理论依据。