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目的胶质瘤是中枢神经系统(central nervous system,CNS)最常见的原发性恶性肿瘤,占颅内肿瘤的50%-60%,传统的治疗方式为手术结合放化疗的综合治疗手段,但患者复发率高,预后较差,低级别胶质瘤患者的中位生存时间为3-5年,而高级别的胶质瘤患者中位生存时间仅为1年,对人们的健康产生极大的威胁,我国是脑胶质瘤高发地区,发病人数及死亡人数都逐年上升,而胶质瘤的发生、发展均涉及细胞信号转导。与其他肿瘤的发病机理一样,由于原癌基因及抑癌基因失调导致瘤细胞过度增殖。近年来研究表明,高级别脑胶质瘤预后不良的原因之一与其对化疗药物产生的耐药性相关,Nrf2是近年来的研究热点,其参与抗氧化应激与抗肿瘤的作用受到广泛关注。本课题将探讨Keap1-Nrf2信号通路与人脑胶质瘤(U87细胞系)多药耐药蛋白间的关系以及低频低强度超声联合低剂量姜黄素通过Keap1-Nrf2通路对人脑胶质瘤细胞多药耐药蛋白的影响。方法本研究采用U87细胞作为研究对象,前期将U87细胞分为低频超声组:按不同作用强度分为0、3.0、50.4、83.4、142.0和290.0mW/cm~2六组,辐照时间为60s,姜黄素组:0、5、10、20、40umol/l四组,用CCK8法分别检测两组U87细胞的细胞吸光值,并计算增殖率;低频超声作用强度为83.4 mW/cm~2,作用时间为60s,姜黄素浓度为5 umol/l时,U87细胞凋亡率高,而坏死率较低,此条件为本研究提供的低频超声联合低剂量姜黄素诱导U87细胞凋亡的最佳参数,作用于U87细胞;将U87细胞分为空白对照组(Control)、低剂量姜黄素组(C5)、低频低强度超声组(U83.4)及低频低强度超声联合低剂量姜黄素组(C5U83.4)四组,CCK8法分别检测各组U87细胞的吸光值,并计算增殖率,运用免疫荧光染色、Western Blot分别检测各组U87细胞中Nrf2、Keap1、ABCG2及P-gp蛋白的表达差异,利用荧光定量逆转录聚合酶链反应qRT-PCR分别检测Nrf2、Keap1、ABCG2及P-gp在U87细胞中各组的表达情况;将U87细胞分为:常规细胞组(Control)、阴性对照病毒转染组(Scrambled)、慢病毒转染组(Nrf2-down),慢病毒介导的Nrf2沉默使U87细胞Nrf2表达降低,qRT-PCR检测si-Nrf2转染效率,检测各组mRNA Nrf2的表达差异,分别检测si-Nrf2转染后各组U87细胞中Keap1、ABCG2及P-gp的表达情况;用CCK8法检测各组细胞吸光值,并计算增殖率;免疫荧光染色、Western Blot分别检测转染si-Nrf2后各组U87细胞中Keap1、Nrf2、ABCG2及P-gp蛋白的表达情况,得出各组灰度值,采用SPSS 19.0进行统计分析。结果1.增殖抑制率:低频超声组内,与对照组相比,强度≤50.4 mW/cm~2的低频超声对U87细胞无显著增殖抑制作用,而当强度≥83.4mW/cm~2时低强度超声抑制细胞增殖明显,并且随超声强度增加,增殖率显著下降,增殖抑制显著增加,呈强度依赖性;姜黄素组内,与对照组相比,浓度为5umol/L姜黄素组对U87细胞无明显增殖抑制作用,而当浓度≥10umol/L时姜黄素明显抑制细胞增殖,并且随姜黄素浓度增加,增殖率显著下降,呈浓度依赖性。而在随后的联合作用实验中,与Control组及单独作用组C5、U83.4组相比,C5U83.4组对U87细胞增殖抑制作用明显,各组均与对照组相比较,采用单因素方差分析,结果显示联合组对U87细胞增殖抑制有显著性意义(P<0.05)。2.转染前蛋白含量:免疫荧光染色、Western Blot和qRT-PCR法对空白对照组(Control)、低剂量姜黄素组(C5)、低频低强度超声组(U83.4)及低频低强度超声联合低剂量姜黄素组(C5U83.4)各组细胞内蛋白含量进行测定,观察Nrf2、Keap1、ABCG2、P-gp及GAPDH蛋白的表达情况,结果以测定的灰度值为准,分析Nrf2、Keap1、ABCG2、P-gp及GAPDH的相对表达量,Nrf2、ABCG2、P-gp在Control组内均呈高表达,而Keap1呈低表达。与Control组及单独处理组C5、U83.4组相比,C5U83.4组细胞内Nrf2、ABCG2、P-gp的表达量显著下降,而Keap1的表达量显著增加。各组均与对照组相比较,采用单因素方差分析,联合组各蛋白表达量变化均有显著性意义(P<0.05)。3.si-Nrf2转染效率:qRT-PCR对常规细胞组(Control)、阴性对照病毒转染组(Scrambled)、慢病毒转染组(Nrf2-down)三组mRNA Nrf2的表达进行检测,Nrf2-down组mRNA Nrf2表达量较Control组及Scrambled组明显下降,Control组与Scrambled组中mRNA Nrf2表达量表达无差异。各组均与对照组相比较,采用单因素方差分析,Nrf2-down组mRNA Nrf2表达量变化有显著性意义(P<0.05)。4.转染后蛋白含量:免疫荧光染色、Western Blot和qRT-PCR法对常规细胞组(Control)、阴性对照病毒转染组(Scrambled)、慢病毒转染组(Nrf2-down)各组细胞内蛋白含量进行测定,观察Nrf2、Keap1、ABCG2、P-gp及GAPDH蛋白的表达情况,结果以测定的灰度值为准,分析Nrf2、Keap1、ABCG2、P-gp及GAPDH的相对表达量,Nrf2、ABCG2、P-gp在Control组及Scrambled组内均呈高表达,而Keap1呈低表达。与Control组及Scrambled组相比,Nrf2-down组细胞内Nrf2、ABCG2、P-gp的表达量显著下降,而Keap1的表达量显著增加。各组均与对照组相比较,采用单因素方差分析,Nrf2-down组蛋白表达量变化均有显著性意义(P<0.05)。结论1.与Control组相比,C5U83.4组对U87细胞增殖抑制作用明显,且强于任一单独作用组C5、U83.4组对U87细胞的增殖抑制作用。2.在U87细胞内Nrf2与Keap1可能同样存在负相关性,且Nrf2蛋白水平的变化在一定程度上可以影响ABCG2、P-gp蛋白含量的变化,而低频低强度超声联合低剂量姜黄素可能具有明显逆转胶质瘤耐药性的作用。3.si-Nrf2下调Nrf2蛋白表达水平后,证实Nrf2与Keap1在U87细胞内的表达存在相关性,构成Keap1-Nrf2通路,在胶质瘤复杂的生物学行为中起到一定的作用,可能参与胶质瘤耐药性的过程,而当Nrf2蛋白表达水平下调后,ABCG2、P-gp蛋白表达下调。4.低频超声联合低剂量姜黄素可能通过Keap1-Nrf2信号通路降低人脑胶质瘤细胞多药耐药蛋白的表达。