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目的:通过观察健康志愿者与不同程度哮喘患者外周血中性粒细胞(neutrophil,NEU)百分比,分离中性粒细胞检测中性粒细胞KLF2、S1PR1的表达及中性粒细胞的迁移率,探讨KLF2与S1PR1对哮喘患者外周血中性粒细胞迁移的影响,从而为哮喘的防治提供新思路。方法:随机收取2014年04月-2016年03月于湖南省马王堆医院及长沙市第三医院住院的急性发作期哮喘患者29例,按照病情程度分为轻度哮喘组(L组)、中度哮喘组(M组)、重度哮喘组(S组),选取年龄、性别与哮喘患者相匹配的健康自愿者作为健康对照组(C组)。于入院6小时内采取外周血分离中性粒细胞,随后进行染色鉴定,免疫荧光明确KLF2在中性粒细胞上的定位,采用Realtime-PCR检测各组研究对象中性粒细胞KLF2与S1PR1m RNA的表达,Western-blot检测各组研究对象中性粒细胞KLF2与S1PR1蛋白的表达,利用Transwell小室测定中性粒细胞的迁移率。结果:1.各组研究对象外周血白细胞分类计数健康对照组、轻、中、重度哮喘组外周血中性粒细胞百分比呈升高趋势,分别为(61.35(51.90~65.70)、62.54(54.75~66.12)、70.20(65.34~75.50)、89.84(73.35~94.57)),且健康对照组、轻度哮喘组与重度哮喘组比较,健康对照组、轻度哮喘组与中度哮喘组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。2.中性粒细胞的分离及鉴定采用梯度离心法及时分离外周血中性粒细胞,然后用PBS重悬,进行迪夫染色,油镜下观察中性粒细胞核呈肾型、杆状及分叶核,纯度达到95%以上。台盼蓝染色鉴定存活率大于90%。3.外周血中性粒细胞KLF2的定位免疫荧光结果示:KLF2在人外周血中性粒细胞中表达,主要定位于中性粒细胞胞核,胞浆亦有少量表达。4.各组研究对象外周血中性粒细胞KLF2与S1PR1 m RNA的表达对于健康对照组、轻、中、重度哮喘组,KLF2 m RNA的表达(1.00(0.96~1.05)、0.80(0.77~0.85)、0.49(0.45~0.52)、0.33(0.32~0.35))依次呈下降趋势,而S1PR1 m RNA的表达(0.99(0.76~1.21)、2.45(2.11~2.81)、3.68(3.41~5.50)、7.52(6.89~7.98))依次呈上升趋势。这两个因子,中、重度哮喘组与健康对照组比较,重度哮喘组与轻度哮喘组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。5.各组研究对象外周血中性粒细胞KLF2与S1PR1蛋白的表达Western-blot分析结果示:对于健康对照组、轻、中、重度哮喘组,KLF2蛋白的表达(0.515(0.390~0.605),0.450(0.385~0.545),0.370(0.310~0.430),0.260(0.245~0.300))依次呈下降趋势,而S1PR1蛋白的表达(0.250(0.233~0.345),0.350(0.290~0.435),0.400(0.360~0.410),0.540(0.490~0.615))依次呈上升趋势,且以上两个因子,中、重度哮喘组与健康对照组比较,重度哮喘组与轻度哮喘组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。6.各组研究对象外周血中性粒细胞迁移率的测定根据我室前期预实验结果选取0.1u M的S1P进行Transwell实验,迁移率结果显示:健康对照组、轻、中、重度哮喘组中性粒细胞迁移率依次(4.28(3.04~5.06),10.35(9.40~11.18),16.05(14.70~18.15),20.70(19.05~22.80))呈增加趋势。轻、中、重度哮喘组与健康对照组比较,重度哮喘组与轻度哮喘组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。7.研究对象外周血中性粒细胞KLF2 m RNA及蛋白与S1PR1 m RNA及蛋白表达的相关分析所有研究对象外周血中性粒细胞KLF2与S1PR1 m RNA表达做Pearson相关分析(r=-0.891,P<0.01),而KLF2与S1PR1蛋白的Pearson相关分析显示(r=-0.671,P<0.01),提示无论在m RNA或蛋白表达水平KLF2与S1PR1的表达量均呈负相关。8.研究对象中性粒细胞KLF2、S1PR1蛋白表达与中性粒细胞迁移率的相关分析KLF2蛋白表达与中性粒细胞迁移率做Pearson相关分析,结果示(r=-0.664,P<0.01),提示两者呈负相关。S1PR1蛋白表达与中性粒细胞迁移率做Pearson相关分析,结果显示(r=0.810,P<0.01),提示两者呈正相关。结论:1.哮喘患者中性粒细胞KLF2的表达随着哮喘严重程度的加重而下降,趋化因子受体S1PR1的表达随着哮喘严重程度的加重而上升,中性粒细胞的迁移率随之而升高。2.哮喘患者外周血中性粒细胞KLF2表达下调可能通过负调控趋化因子受体S1PR1的表达,促进中性粒细胞迁移。