背景:线粒体是细胞内最重要的细胞器,它可以整合代谢物以产生ATP并保证细胞正常运行所需的能量。同时线粒体还影响了多种细胞功能并贯穿细胞命运始终。因此线粒体功能的稳定是细胞正常工作的前提,这也导致了线粒体损伤或功能障碍通常会导致严重后果,比如细胞的衰老与钙化。线粒体DNA聚合酶（DNA polymerase gamma,Polγ）是线粒体内唯一起聚合酶作用与外切酶作用的多功能酶,负责线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）的复制、表达和校正,以保证呼吸链复合物相关蛋白亚基的表达并维持线粒体功能。Polγ可以通过影响线粒体的生物学行为,影响线粒体的生物发生与质量控制,最终维持线粒体功能的稳定。POLGD257A/D257A转基因遗传小鼠是POLG发生点突变而导致的线粒体损伤动物模型,D257A点突变使Pol γ的3’-5’核酸外切酶活性出现损伤甚至丧失,导致突变或缺陷mtDNA数量显著增加并造成了一系列严重的表型变化,如过早衰老、脊柱畸形与严重的扩张型心肌病。血管钙化（vascular calcification,VC）是不溶性钙盐与磷盐在血管壁上异位沉积,常见于动脉内膜或中层,被认为是一种衰老相关的退行性病理改变。血管中层平滑肌钙化常见于大多数慢性病的晚期病理变化,如高血压、糖尿病和慢性肾病,另外血管钙化的出现也通常预示着不良的临床预后。有研究发现在钙化血管中常可观察到线粒体功能障碍和细胞代谢改变。然而,POLGD257A/D257A小鼠在血管钙化方面的研究尚未充分开展,Polγ是否参与到血管钙化过程以及在血管钙化中的作用还不明确,同时这种特定的外切酶缺陷POLG基因突变前后在钙化刺激下是否会有功能上的差异还有待研究。p53是细胞内最重要转录因子并参与多种细胞生物进程,其中之一就是通过多种途径对线粒体进行调控。有研究认为p53可以对线粒体进行氧化还原稳态和代谢调节,还有研究提出p53可以通过调控线粒体的生物发生与影响线粒体自噬和凋亡的途径对线粒体进行质量控制。此外还有研究报道p53可以对不同的线粒体相关基因通过转录调控的方式促进有氧代谢水平,间接的影响线粒体的功能。在对损伤的应答方面,一些研究结果提示p53会与Polγ发生互作以修复损伤的mtDNA。但关于钙化刺激条件下p53是否也会通过与Pol γ互作的方式间接的参与到线粒体功能的维持与钙化过程尚无明确结论,Polγ的突变是否会影响p53的生物学行为与功能也尚不清楚。目的:本课题借助POLGD257A/D257A线粒体缺陷小鼠模型,围绕Pol γ、p53与钙化展开研究,解析Pol γ在维持线粒体功能与细胞钙化过程中的作用,通过对比Pol γ突变前后的不同作用,探究Pol γ与p53在线粒体功能与细胞钙化过程调控中的潜在机制。材料与方法:第一部分中,我们使用维生素D3（Vitamin D3,Vit D3）对POLGWT/WT小鼠与POLGD257A/D257A小鼠进行血管钙化诱导并对比二者之间主动脉血管钙化程度的差异。同时我们构建了 Pol γ过表达与敲减的VSMCs,使用10mmol的β磷酸甘油（beta-glycerophosphate,β-GP）对VSMCs进行体外钙化诱导,检测不同Pol γ水平下线粒体功能与钙化水平变化。在此基础上我们设计了 Polγ点突变质粒,通过对VSMCs进行不同种类Pol 丫的过表达来对比Pol γ突变前后稳定线粒体与减弱钙化损伤方面的功能改变。在此基础上,我们在Pol γ敲减的VSMCs中进行WT-Polγ丫与Mutant-Pol γ的回补来比较二者对挽救Pol γ导致的线粒体功能方面的不同作用,并观察得到挽救的线粒体功能是否会抑制钙化水平。在线粒体功能检测方面,我们分别检测了线粒体的膜电位变化、ATP产量与ND-1的mRNA水平从而反映线粒体的结构、功能与数量上的变化。在钙化方面,本实验使用茜素红染色与钙离子定量检测来反映钙化结节的形成与钙盐沉积水平,并通过检测钙化过程中关键蛋白的表达水平来综合的评价血管组织或VSMCs的钙化程度。第二部分实验中我们构建了 p53敲除的VSMCs并检测不同p53水平与钙化条件下的细胞线粒体功能变化。在使用10mmolβ-GP进行钙化造模情况下,分别在p53敲除的VSMCs中过表达Polγ,在Polγ敲减的VSMCs中过表达p53质粒,通过对比二者的线粒体功能明确Polγ与p53在维持线粒体稳定抑制细胞钙化中的角色与上下游关系。同时在使用β-GP进行钙化诱导的条件下对VSMCs的线粒体进行分离,检测p53在不同亚细胞结构中的表达水平变化以及明确钙化对p53位置变化的影响。最后在Vit D3诱导的POLGWT/WT小鼠与POLGD257A/D257A小鼠的血管组织进行免疫共沉淀实验,明确Polγ与p53共同参与钙化过程的潜在机制,并在VSMCs中通过半外源过表达的免疫共沉淀实验对体内结合实验进行补充。结果:第一部分功能学实验中我们观察到POLGD257A/D257A小鼠在钙化条件下比POLGWT/WT小鼠表现了更严重的血管钙化改变。细胞的体外实验结果表明pol γ的过表达可以上调各项线粒体功能指标,另外过表达组的VSMCs钙化程度得到了缓解。同时Polγ的缺失导致β-GP刺激下的细胞线粒体膜电位显著下降、ATP含量与mtDNA拷贝数出现显著的减少,并且β-GP的诱导钙化出现显著的加重。但是这种线粒体功能损伤与细胞钙化可以通过过表达Pol γ而得到挽救。但是在发生点突变之后,Mutant-Pol γ单纯过表达无法改善线粒体功能并缓解钙化程度。并且不同于WT-Pol γ,Mutant-Pol γ过表达后没有观察到β-GP刺激下的ShPol γ细胞出现线粒体功能上调与钙化程度的减轻,依旧表现为线粒体功能损伤与严重的细胞钙化。第二部分机制实验中我们观察到Pol γ的过表达可以显著上调线粒体各项功能指标。另外钙化刺激导致的线粒体损伤会促进p53会发生Ser392位点磷酸化并易位进入线粒体。WTPolγ可以与p53相结合形成复合体,并且在钙化刺激下这种结合会发生显著增强。然而Mutant Polγ在生理情况下与p53结合已维持在较高水平,但是钙化刺激无法进一步增强Mutant Polγ-p53复合体的结合水平,甚至出现下降。结论:Polγ异常导致的线粒体功能损伤会促进VSMCs在外界刺激诱导条件下的钙化发生。Polγ可以维持线粒体稳定并挽救线粒体功能,以抵抗外源性钙化刺激。但是Polγ发生D257A点突变后失去了在损伤刺激下维持线粒体稳定的作用,也无法挽救Polγ缺失导致的线粒体功能障碍,并且不再具备抑制VSMCs钙化的作用,提示Polγ核酸外切酶功能的完整性在维持线粒体功能稳定与抑制钙化过程中至关重要。另外在维持线粒体功能稳定中,Polγ是影响线粒体功能的直接执行分子,p53可以下游调控并辅助Polγ进行mtDNA的校正与稳定,从而间接的参与稳定线粒体功能过程。钙化导致VSMCs出现线粒体损伤情况下,p53会易位进入线粒体辅助维持线粒体功能,并且p53的Ser392位磷酸化在p53易位至线粒体过程中起到重要作用。另外Polγ发生D257A突变前后在同p53形成复合体应答钙化导致的mtDNA损伤启动修复机制的能力存在差异,Mutant Polγ-p53面对损伤刺激的应答能力减弱,无法在病理性损伤情况下进一步激活来维持mtDNA的稳定性并抑制钙化。