重症休克时血管反应性低下,微血管对升压药物不起反应,带来血压持续下降和重要脏器灌流不足,它是晚期休克难以治疗和休克死亡的重要原因之一。本室前期工作查明,休克时ATP生成减少,导致细动脉平滑肌细胞（arteriolarsmooth muscle cells,ASMCs）ATP敏感钾通道(ATP-sensitive potassium channel,K_ATP)大量开放和细胞膜超极化,是血管平滑肌低反应性重要机制之一。但是重症创伤失血性休克晚期,经过输血、补液、升压药物等抗休克治疗以后,血压仍难以回升,为什么给了氧气和养料以后,血管平滑肌仍然对升压物质不起反应。它提示重症休克ASMCs内ATP的减少,不仅来自氧气和养料供应不足,还可能由于线粒体本身发生损伤,线粒体功能不全（mitochondrial dysfunction）使ATP合成减少。如果线粒体确实发生了损伤,保护血管平滑肌线粒体则成为防治休克低血压新的靶点和思路,但至今尚未见报道。为此,本实验利用大鼠失血性休克模型,采用透射电镜、荧光探针技术、生物化学发光和膜片钳等技术,分别从线粒体、平滑肌细胞、血管反应性和整体抗休克四个不同水平研究了研究重症失血性休克平滑肌细胞线粒体的改变及其与血管平滑肌反应性下降的关系,摘要如下。第一部分重症休克血管平滑肌细胞线粒体的改变一、血管平滑肌细胞线粒体超微结构的改变:分离重症失血性休克给予一般抗休克治疗60min（单纯休克组）时ASMCs,以及相同时间点假手术组、休克+环孢霉素A组、休克+苍术苷+环孢霉素A组ASMCs。用透射电镜观察到假手术组大鼠血管平滑肌线粒体包膜完整,嵴致密、连续,基质清楚;单纯休克组线粒体肿胀,嵴排列紊乱,甚至断裂,形成电子透亮区,基质成斑点状,甚至空泡状;休克前给予线粒体通透性转变孔抑制剂环孢霉素A（CsA）预处理,此组线粒体有一定的水肿,但结构较完整,嵴较致密,排列较整齐,少部分断裂;线粒体通透性转变孔开放剂苍术苷（ATR）可抑制环孢霉素A线粒体保护作用。血管平滑肌细胞线粒体体视学参数比较结果显示,与假手术组比较,重症失血性休克线粒体肿胀的衡量体积大小和形态学参数—面积和周长显著增加,纵横比和圆度显著减小（P=0.000）。与单纯休克组比较,环孢霉素A预处理组线粒体面积和周长显著减小（P=0.000）,纵横比和圆度显著增加（P=0.000）。而苍术苷预处理组与单纯休克组的线粒体面积、周长和纵横比差异均无显著性。休克时线粒体的重要变化之一是内膜上的通透转变孔（mitochondria permeabilitytransition pore,MPTP）开放,允许离子、代谢产物、分子量在1.5kD以内的物质漏出,但大分子的蛋白质不能自由通过,形成的胶体渗透压引起水分子内流,导致线粒体肿胀。以上结果提示重症休克后,血管平滑肌线粒体结构受损,且与线粒体通透性转变孔开放有关,抑制线粒体通透性转变可以保护线粒体。二、血管平滑肌细胞线粒体膜电位的改变:用流式细胞仪检测阳离子荧光探针JC-1标记的平滑肌细胞线粒体膜电位的改变。单纯休克组线粒体膜电位降低（发射绿色荧光）的细胞百分率为61.11±8.28%,较假手术组（11.40±4.92%）有显著增加（P=0.000）,提示重症休克后,线粒体膜电位发生去极化;环孢霉素A预处理组线粒体膜电位降低的细胞百分率分别为38.72±3.99%,显著低于单纯休克组（P=0.000）;苍术苷可以取消环孢霉素A作用,线粒体膜电位降低的细胞百分率升高为59.39±6.95%,较环孢霉素A预处理组有显著差异（P=0.000）,与单纯休克组无显著差异（P=0.972）。以上提示重症休克此期线粒体通透性转变增加,可能促进线粒体膜电位去极化,促进线粒体结构和功能障碍。三、血管平滑肌细胞内ATP水平的改变:利用CellTiter-Glo^?荧光素酶生物发光法检测细胞内ATP相对含量。单纯休克组平滑肌细胞内ATP相对含量仍降低,为假手术组的17.86±6.42%（P=0.000）,提示重症休克发生时给予一般抗休克治疗后,血管平滑肌细胞线粒体仍有功能受损。给予环孢霉素A预处理,平滑肌细胞内ATP水平增加为假手术组的40.15±9.86%,高于单纯休克组且有显著性差异（P=0.003）。给予苍术苷预处理可以抑制环孢霉素A保护作用,平滑肌细胞内ATP水平降低为假手术组的21.60±8.90%（与假手术组相比P=0.000;与单纯休克组相比P=0.894）。以上提示抑制线粒体通透性转变和保护线粒体,可以增加重症休克后细胞内ATP含量。四、血管平滑肌细胞K_ATP通道的改变:用穿孔全细胞膜片钳记录法,在电压钳模式下,记录并观察K_ATP通道电流变化的情况,从K_ATP通道电流的Ⅰ-Ⅴ曲线可见,其反转电位大约为-40mV,无明显整流特性。钳制电压为-100mV时各组K_ATP通道电流变化,假手术组ASMCs电流密度为-1.31±1.75 pA/pF,休克组增加到-8.94±4.40 pA/pF（P=0.000）,Ⅰ-Ⅴ曲线上移。提示重症失血性休克此期由于血管平滑肌细胞内ATP含量减少,导致K_ATP通道开放增加。环孢霉素A可使重症休克时电流密度减小到-3.71±2.64 pA/pF（P=0.002）。苍术苷可抑制环孢霉素A作用,使电流密度增加到-12.21±5.46 pA/pF,与单纯休克组无显著差异（P=0.384）。其它钳制电压下的K_ATP通道电流改变也符合此趋势。以上结果提示抑制线粒体通透性转变和保护线粒体,可以抑制K_ATP通道开放。五、血管平滑肌细胞膜电位的改变:同时应用全细胞膜片钳术电流钳模式,记录单个细胞的静息跨膜电位。单纯休克组ASMCs静息膜电位由假手术组（n=31 cells）的-32.1±5.1mV增加到-48.5±8.2 mV（P=0.000）,提示重症休克此期血管平滑肌细胞发生了超极化改变。环孢霉素A预处理组ASMCs静息膜电位为-37.8±7.7 mV,与单纯休克组差异显著（P=0.011）,其作用可被苍术苷抑制,该组ASMCs静息膜电位（-50.6±11.1 mV）与单纯休克组无显著差异（P=0.972）。以上提示抑制线粒体通透性转变和保护线粒体,可抑制重症休克后血管平滑肌细胞超极化。第二部分血管平滑肌线粒体损伤细胞模型的建立和对收缩反应的影响为了确证线粒体损伤能引起平滑肌收缩反应下降,用线粒体损伤剂（MPTP开放剂）ATR建立了体外平滑肌细胞线粒体损伤模型,并进行了以下实验:一、ATR对血管平滑肌细胞线粒体膜电位的影响:当加入不同浓度ATR后,引起正常细胞和休克细胞线粒体膜电位降低的细胞百分率增加,即细胞线粒体去极化,且正常细胞和休克细胞之间有显著差异（析因分析,F=204.676,P=0.000）,休克细胞组（均数为48.52%）显著高于正常细胞组（均数为23.13%）。ATR不同浓度作用之间有显著差异（F=101.780,P=0.000）。在正常细胞组分别在ATR作用10min和30min时,随加入ATR浓度增高,线粒体去极化越显著,且两两比较均有显著差异（F=37.907,P=0.000;F=41.501,P=0.000）。在休克细胞组分别在ATR作用10min和30min时,随其浓度增高线粒体去极化改变有显著差异（F=29.093,P=0.000;F=22.468,P=0.000）,5μM和7.5μM ATR对线粒体去极化改变均无显著差异（10min:P=0.858;30min:P=1.000）。用药后不同时间之间无显著差异（F=1.055,P=0.309）。以上结果提示ATR可能通过促进线粒体通透性转变孔的开放,引起平滑肌细胞线粒体去极化,抑制线粒体作用甚至诱导线粒体损害,此作用具有一定浓度依赖性但无时间依赖性。二、ATR对血管平滑肌细胞内ATP含量和膜电位的影响:用生物化学发光法和激光共聚焦显微镜技术,测定7.5μM ATR体外作用于正常组和休克组血管平滑肌细胞10min对平滑肌细胞内ATP含量和膜电位的影响。正常血管平滑肌细胞在ATR作用10min后,平滑肌细胞内ATP含量减少,比ATR处理前减少25%,有显著差异（t=3.389,P=0.01）,但ATR对正常细胞膜电位无显著影响,提示7.5μM ATR对线粒体抑制可直接导致正常平滑肌细胞内ATP水平降低,但此改变并未影响到细胞膜电位。ATR使休克血管平滑肌细胞内ATP含量减少,为ATR处理前的59%,有显著差异（t=3.904,P=0.005）。膜电位发生超极化,表现为荧光强度减弱为加药前的72.74±4.19%（加药前后比较用配对的t检验,t=14.550,P=0.000）,提示此条件下休克平滑肌细胞内ATP水平降低,它可导致细胞膜电位发生超极化改变。作为对照,溶剂HPSS对正常和休克平滑肌细胞膜电位均无显著影响。三、ATR对血管平滑肌细胞收缩反应的影响:分别观察了7.5μM ATR体外对正常组和休克组离体血管平滑肌细胞对NE（正常组1μg/ml,休克组60μg/ml）的反应性的影响。结果表明,正常血管平滑肌细胞在ATR作用10min后,用NE刺激面积减少了37.83±5.74%,与未加ATR处理的正常细胞收缩百分率（44.10±3.30%）有显著差异（t=2.318,P=0.043）。休克血管平滑肌细胞ATR作用10min后,用NE刺激面积减少了10.94±2.78%,与未加ATR处理的休克细胞收缩百分率（25.59±2.37%）有显著差异（t=9.816,P=0.000）（见表5）。提示线粒体抑制可直接导致平滑肌细胞收缩反应减弱,可能与细胞内ATP水平减低有关。第三部分保护线粒体药物—CsA在整体大鼠防治休克血管低反应性和低血压可能性为了进一步查明线粒体在重症休克后血管低反应性发生中的作用,我们在整体试验观察了线粒体靶向药物对重症休克时血管对去甲肾上腺素（NE）的反应性和血压影响。重症休克失血120min后,回输血液和给予升压药多巴胺（1mg/kg）后治疗60min时,血管对NE刺激产生收缩阈值仍增高,为失血前40.9倍,血压比失血120min时仅上升了11.7 mmHg。同时,在CsA预处理组,血管对NE刺激产生收缩阈值增加为失血前20.6倍,血压比失血120min时上升了34.2mmHg。说明给予线粒体保护剂CsA,可降低血管对NE反应阈值（P=0.000）,并可显著增加多巴胺的升压作用（P=0.000）;CsA预处理前给予ATR,则可消除CsA的保护效应。以上结果表明,抑制线粒体通透性转变和保护线粒体有利于恢复休克血管反应性和防止低血压,为重症休克顽固性低血压治疗提出了一条新途径。然而CsA可以使重症休克动物生存时间明显延长的同时,并不能显著提高休克动物的24小时存活率,CsA预处理组24h动物存活率仅为3/8。说明休克低血管反应的发生还有其它机制参与,同时CsA有免疫抑制等副作用,它并不是理想的抗休克药物。结论:1.制备线粒体损伤的细胞模型和重症失血性休克大鼠模型,建立血管平滑肌线粒体损伤的系列测定方法,检测它与血管收缩反应的关系。2.查明重症休克血管平滑肌细胞（ASMCs）由于线粒体损伤,在输血补液治疗以后仍引起合成ATP功能不全,导致K_ATP通道激活、ASMCs超极化、及低血管反应发生,它是重症休克顽固性低血压重要的发生机制之一。3.证明直接保护线粒体是重症休克治疗顽固性低血压的一个新途径。